大粒車前子多糖對脂多糖刺激RAW264.7巨噬細胞的免疫調節作用

李芬芬，黃丹菲，江樂明，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

大粒車前子多糖對脂多糖刺激RAW264.7巨噬細胞的免疫調節作用

李芬芬，黃丹菲，江樂明，謝明勇*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

采用脂多糖構建RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，研究大粒車前子多糖的抗炎作用。培養巨噬細胞RAW264.7，利用脂多糖構建細胞炎癥模型，中性紅吞噬實驗檢測細胞吞噬活性；酶聯免疫吸附法檢測車前子精制多糖（Plantago asiat ica L. crude polysaccharide，PLCP）處理前后細胞上清液中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和IL-6的分泌量，Griess反應測定RAW264.7細胞釋放NO水平。結果表明，PLCP可顯著抑制RAW264.7炎癥細胞的吞噬活性，降低炎癥細胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的釋放量。

大粒車前子；多糖；RAW264.7巨噬細胞；炎癥；抗炎

車前子為大粒車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟種子[1]，其種皮含有大量的黏液質，是由阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖構成的雜多糖[2]，具有整腸通便[3]、降低血脂、調節血糖[4]、免疫調節[5-6]及抗氧化清除自由基[7]等功能，但有關其在抗炎方面的研究并不多，而其產生抗炎作用的分子生物學機制也還不明確。

炎癥是機體的防御性反應，通常對機體是有利的，但過度的炎癥反應會導致體內釋放過多的炎癥性介質，引起局部或全身的炎癥性反應[8]。巨噬細胞是機體重要的免疫調節及效應細胞，參與機體的大多數免疫反應，它能清除衰老的宿主細胞和分子，在機體抵御感染的過程中也起到重要的作用[9]，是炎癥過程的關鍵角色之一，主要體現在炎癥部位高濃度趨化因子誘導巨噬細胞活化并向感染部位募集，活化的巨噬細胞進一步分泌白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等趨化因子，誘導更多的巨噬細胞活化募集，釋放IL-6等促炎癥因子及前列腺素等炎癥介質，誘導和加強局部炎癥反應[10-11]。本實驗擬通過脂多糖（lipopolyssacharide，LPS）刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7建立炎癥細胞模型，探討車前子多糖對巨噬細胞的抗炎作用，不僅為深入研究車前子抗炎活性物質及其作用機制提供實驗基礎，也為開發大粒車前子資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子產自江西吉安；RAW264.7細胞系購自上海細胞生物研究所。

RPMI 1640培養基 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、L-谷氨酰胺、β-二巰基乙醇、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素 美國HyClone公司；Griess檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；LPS 美國Sigma公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒 武漢博士德公司；中性紅 溫州市化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

3K15-高速冷凍離心機 德國Sigma公司；酶標儀美國Bio-Rad公司；CO2培養箱 美國Thermo公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 大粒車前子多糖的提取與純化

采用水提醇沉法從大粒車前子中提取多糖成分，優化的提取條件為：大粒車前子粉末與水（1∶10，m/V）在100 ℃下提取3 h，重復2 次。將提取液合并濃縮，80%乙醇沉淀過夜。4 800 r/min離心10 min收集多糖沉淀，并依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇各洗滌2 次，干燥得車前子多糖，得率約為10.0%。采用Sevag法對車前子多糖進行脫蛋白處理制備得到精制車前子多糖（Plantago asiatica L. crude polysaccharide，PLCP）[7]。

1.3.2 細胞培養與模型建立

用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基培養（37 ℃、5% CO2）RAW264.7巨噬細胞并對其進行分組?？瞻讓φ战M：不用LPS處理也不加多糖干預；模型對照組：加入10 mg/L的LPS干預；實驗組：10 mg/L的LPS干預，并用PLCP（PLCP終質量濃度分別為20、40、80、160 μg/mL）處理。

1.3.3 細胞吞噬活性 測定

調節RAW264.7巨噬細胞密度為5×105個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板，置于培養箱（37 ℃、5% CO2）培養3 h后洗去未貼壁細胞。每孔加入100 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，各組按相應處理加入LPS、PLCP進行培養。24 h后每孔加入含中性紅（體積分數0.1%）的生理鹽水溶液100 μL，繼續培養4 h，棄去上清液，用PBS洗3 遍，每孔加入細胞溶解液（V（冰醋酸）∶V（乙醇）=1∶1）100 μL，4 ℃條件下放置2～3 h，待細胞溶解后在酶標儀上測定540 nm波長處的光密度值。

1.3.4 NO分泌水平測定

采用Griess法對NO－2定量間接檢測NO生成。RAW264.7巨噬細胞接種于96 孔培養板，各組細胞在不同處理因素作用24 h后，每孔取細胞培養液50 μL，用Griess試劑測試，酶標儀550 nm波長處測定吸光度。根據NaNO2制得的標準曲線計算培養基中NO的生成量。

1.3.5 細胞因子分泌水平測定

取RAW264.7巨噬細胞接種于24 孔細胞培養板中，不同組別按照相應處理培養24 h后，取上清液進行測定。TNF-α、IL-10和IL-6水平的測定按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞吞噬活性的影響

圖1 PLCP對LPS刺激的RAW264.7細胞中性紅吞噬活性的影響Fig.1 Inhibitory effect of PLCP on the phagocytosis of LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖1所示，與模型對照組相比，PLCP在低質量濃度范圍內（20、40 μg/mL）對LPS激活的RAW264.7細胞的吞噬活性具有顯著抑制作用（P＜0.05）。

2.2 PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞釋放NO的影響

表1 PLCP對LPS刺激的RAW264.7細胞NO分泌水平的影響Table1 Inhibitory effect of PLCP on NO production in mouse macrophage cell line RAW264.7

由表1可知，和空白對照組相比，模型對照組釋放大量NO（P＜0.05），PLCP作用于LPS刺激的RAW264.7細胞后，NO分泌量下降，PLCP質量濃度為40 μg/mL時對細胞分泌NO活性的抑制效果最為顯著（P＜0.05）。

2.3 PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞分泌炎癥細胞因子的影響

表2 PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF--α、IL-6和IL--10水平的影響Table2 Inhibitory effect of PLCP on TNF-α, IL-6 and IL-10 production in LPS-stimulated RAW264.7 cellss

由表2可知，PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞分泌炎癥細胞因子有顯著影響。和模型對照組相比，在40～160 μg/mL范圍內，PLCP能夠明顯抑制LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF-α和IL-6，在20～160 μg/mL范圍內可顯著抑制LPS刺激RAW264.7細胞分泌IL-10，且呈劑量依賴關系。

3 討 論

炎癥反應是一種重要的機體防御過程，涉及機體活動的許多環節，其中免疫細胞（巨噬細胞、中性粒細胞等）的激活是炎癥反應的啟動環節[13]。巨噬細胞是炎癥反應的重要效應細胞，RAW264.7細胞作為巨噬細胞的一種，可激活機體的免疫系統，當機體受LPS等外界因素刺激后，能夠促進機體產生炎癥介質，發揮免疫功能[14]。許多研究發現多糖能調節巨噬細胞的功能，并揭示了多糖與其表面受體及信號轉導通路相關的作用機理[15]。因此本實驗以LPS刺激RAW264.7細胞為模型，探討PLCP對巨噬細胞的抗炎作用。

巨噬細胞是一種主要的專職吞噬細胞，是機體的清道夫，可以通過其表面受體識別并吞噬入侵機體的病原菌及本身衰老和死亡的細胞，從而提高機體機能[16]。中性紅吞噬實驗顯示，低質量濃度的PLCP能夠抑制RAW264.7細胞的吞噬活性，說明PLCP可調節炎癥反應，并且低質量濃度的PLCP能有效地防止巨噬細胞的過度活化。

LPS刺激后的巨噬細胞可大量表達誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）并分泌大量的NO。NO作為體內重要的信使和效應分子，對細菌等病原體具有殺傷和細胞毒性作用[17]，從而介導炎癥反應。但NO的過量釋放會損傷正常的細胞，引起過度炎癥反應。研究發現NO對細菌感染、創傷等均具有很好的療效[18]。巨噬細胞NO的合成、分泌與細胞因子有著相互調節作用[19]。當PLCP質量濃度在40～160 μg/mL時，能下調RAW264.7細胞釋放NO，這可能與抑制巨噬細胞的活化、減少與iNOS表達相關炎癥因子的釋放有關。

免疫細胞產生的許多細胞因子參與免疫系統的調節，而植物多糖對細胞因子以及受體表達的影響是其發揮抗炎作用的重要分子機制。TNF-α是巨噬細胞在炎癥反應中產生的主要促炎細胞因子，可調節細胞的生長分化、增殖，調節免疫應答，以正反饋調控的形式參與許多炎癥反應，具有重要的生物功能[20]。因此，本實驗測定了PLCP對LPS刺激RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響，結果發現PLCP在40～ 160 μg/mL范圍內可顯著抑制RAW264.7細胞分泌TNF-α，且具有一定的劑量依賴性。由此可以說明PLCP可能通過下調TNF-α的表達參與抗炎反應。IL-10是一種可由活化的單核-巨噬細胞產生的多功能抗炎細胞因子，可調節多種免疫細胞的功能[21-22]，通過負反饋調節發揮抗炎作用[23]。本實驗發現在實驗劑量范圍內PLCP均可顯著抑制IL-10的釋放，并符合劑量依賴關系。IL-6在先天性免疫和獲得性免疫中都具有突出的貢獻[24]，可調控T淋巴細胞的分化和激活，誘導輔助T細胞的活化，維持調節性T細胞和輔助性T細胞間的平衡，在慢性炎癥中發 揮了重要作用[25]。本實驗發現在40～160 μg/mL范圍內PLCP可顯著下調LPS刺激RAW264.7細胞分泌IL-6。以上結果表明，PLCP的抗炎作用可能與抑制細胞因子的表達，保持TNF-α、IL-10和IL-6之間的平衡有關。

綜上所述，PLCP可通過抑制LPS刺激巨噬細胞的吞噬作用、NO的釋放及細胞因子的表達發揮其抗炎作用，其具體的抗炎作用機制還有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2010: 63.

[2] YIN Junyi, LIN Huixia, LI Jing, et al. Structural characterization of a highly branched polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L.[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(4): 2416-2424.

[3] MARLETT J A, FISCHER M H. A poorly fermented gel from psyllium seed husk increases excreta moisture and bile acid excretion in rats[J]. Journal of Nutrition, 2002, 132(9): 2638-2643.

[4] ANDERSON J W, ALLGOOD L D, TURNER J, et al. Effects of psyllium on glucose and serum lipid responses in men with type 2 diabetes and hypercholesterolemia[J]. American Journal of Clinical Nut rition, 1999, 70(4): 466-473.

[5] HUANG Danfei, TANG Yongfu, NIE Shaoping, et al. Effect of phenylethanoid glycosides and polysaccharides from the seed of Plantago asiatica L. on the maturation of muri ne bone marrow-derived dendritic cells[J]. European Journal of Pharmacology, 2009, 620(1/3): 105-111.

[6] HUANG Danfei, XIE Mingyong, YIN Junyi, et al. Imm unomodulatoryactivity of the seeds of Plantago asiatica L.[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009, 124(3): 493-498.

[7] YE Chunlin, HU Weilian, DAI Dehui. Extraction of polysaccharides and the antioxidant activity fr om the seeds of Plantago asiatica L.[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 49(4): 466-470.

[8] SCHEPETKIN I A, QUINN M T. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulat ion and therapeutic potential[J]. International Immunopharmacology, 2006, 6(3): 317-333.

[9] GORDON S. Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune respons e[J]. Cell, 2002, 111(7): 927-930.

[10] 楊一新, 李桂源. LPS所介導的信號轉導通路研究進展[J]. 中南大學學報: 醫學版, 2006, 31(1): 141-145.

[11] MARTINEZ F O, SICA A, MANTOVANI A, et al. Macrophage activation and polarization[J]. Frontiers in Bioscience, 2008, 13: 453- 461.

[12] MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. Journal of Immunological Methods, 1983, 65(1): 55-63.

[13] 龐然, 張淑玲, 趙雷, 等. 草木犀正丁醇提取物對小鼠巨噬細胞促炎介質的影響[J]. 中國現代醫學雜志, 2009, 19(19): 2893-2896.

[14] RHULE A, NAVARRO S, SMITH J R, et al. Panax notoginseng attenuates LPS-induced pro-inflammatory mediators in RAW264.7 cells[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 106(1): 121-128.

[15] 榮岳光, 佟建明. 多糖對巨噬細胞功能影響的研究進展[J]. 中國畜牧獸醫, 2007, 34(5): 9-13.

[16] 葉莎莎, 曾耀英, 尹樂樂. 紅景天苷對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖、凋亡、吞噬、ROS和NO產生的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(3): 237-241.

[17] 呂夢捷, 曾耀英, 宋兵. 人參皂甙Rb1對小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬及 細胞因子和NO分泌的影響[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(3): 242-244.

[18] CARPENTER A W, SCHOENFISCH M H. Nitric oxide release: Part II. Therapeutic applications[J]. Chemical Society Review s, 2012, 41(10): 3742-3752.

[19] 楊光, 李鳴真. 一氧化氮與炎癥及免疫調節[J]. 國外醫學: 免疫學分冊, 1995, 18(6): 303-307.

[20] TOUSSIROT E, WENDING D. The use of TNF-α blocking agents in rheumatoid arthritis: an update[J]. Expert Opin Pharmacother, 2007, 8(13): 2089-2107.

[21] ULUI?IK D, KESKI N E. The effects of ginseng and echinacea on some plasma cytokine levels in rats[J]. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 2012, 18(1): 65-68.

[22] LIANG Guang, ZHOU Huiping, WANG Yi, et al. Inhibition of LPS-induced production of inflammatory factors in the macrophages by mono-carbonyl analogues of curcumin[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2009, 13(9b): 3370-3379.

[23] 舒曠 怡, 張穎, 楊錦紅, 等. LBP對LPS刺激巨噬細胞分泌細胞因子的調節作用[J]. 解放軍醫學雜志, 2010, 35(8): 937-941.

[24] JONES S A. Directing transition from innate to acquired immunity: def ning a role for IL-6[J]. The Journal of Immunology, 2005, 175(6): 3463-3468.

[25] ALCIATO F, SAINAGHI P P, SOLA D, et al. TNF-α, IL-6, and IL-1 expression is inhibited by GAS6 in monocytes/macrophages[J]. Journal of Leukocyte Biology, 2010, 87(5): 869-875.

Immunoregulatory Effect of Polysaccharide from the Seeds of Plant ago asiatica L. on RAW264.7 Cells Stimulated with Lipopolysaccharide

LI Fen-fen, HUANG Dan-fei, JIANG Le-ming, XIE Ming-yong*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

To study the immunoregulatory effect of polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L. on RAW264.7 cells, a model of inf ammation stimulated with lipopolysaccharide (LPS) was established. The phagocytic activity of the cells was observed by neutral red phagocy tosis experiments. At the same time, the levels of TNF-α, IL-10 and IL-6 in the cultural supernatant were quantif ed before and after addition of crude polysaccharide from Plantago asiatica L. (PLCP) by ELISA. In addition, the expression of NO which was suppressed by the polysaccharide was studied. The results showed that the polysaccharide could suppress cytokine levels, NO expression and phagocytic activity.

Plantago asiatica L.; polysacchar ide; RAW264.7 cells; inf ammation; anti-inf ammation

TS201.2

A

1002-6630（2014）23-0249-04

10.7506/spkx1002-6630-201423048

2014-06-26

國家自然科學基金重點項目（31130041）；南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室青年骨干研究基金項目（SKLF-QN-201107）；國家自然科學基金地區科學基金項目（31260364）；江西省教育廳青年科學基金項目（GJJ11050）

李芬芬（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：ncusklifenfen@163.com

*通信作者：謝明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品化學、食品營養與安全。E-mail：myxie@ncu.edu.cn