紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用特性

劉 碩，王 萌，朱少華，姜 紅，李小定

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用特性

劉 碩，王 萌，朱少華，姜 紅，李小定*

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

測定紫甘薯花色素與胰蛋白酶反應前后酶的催化活性、催化反應動力學并采用紫外光譜法、熒光光譜法和紅外光譜法研究紫甘薯花色素與胰蛋白酶相互作用 特性。結果表明：紫甘薯花色素對胰蛋白酶催化活性有明顯的抑制作用，抑制類型為可逆的競爭性抑制，抑制常數Ki=6.16×10－4mmol/L，當紫甘薯花色素與胰蛋白酶的物質的量比為140∶1，在 37 ℃反應 15 min，抑制率達到38.61%，而反應時間對催化活性的影響不明顯；紫甘薯花色素可使胰蛋白酶的內源熒光猝滅，猝滅類型為靜態猝滅，室溫下猝滅常數Kq為1.73×1012L/（mol·s），結合常數KA為3.88×104L/mol，結合位點數n為0.86；熱力學參數確定兩者之間的作用力主要為氫鍵和范德華力；根據F?rster能量轉移理論得出它們的結合距離為3.56 nm；紅外光譜經過去卷積、二階導數處理得知與紫甘薯花色素作用后胰蛋白酶的α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高。

紫甘薯花色素；胰蛋白酶；酶學性質；紫外光譜；熒光光譜；紅外光譜

胰蛋白酶是一種人和動物腸道內的蛋白水解酶，在消化和新陳代謝過程中發揮著十分重要的作用。它易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機溶劑。胰蛋白酶相對分子質量為23 300，其單一肽鏈含有233 個氨基酸殘基和六對二硫鍵，其結構以β-折疊為主，屬于絲氨酸蛋白酶家族。近年來關于小分子與胰蛋白酶的研究表明，2-氨基苯丙噻唑、蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素都對胰蛋白酶有抑制作用，而油酸鈉對其活性影響不明顯；2-氨基苯丙噻唑和油酸鈉通過氫鍵及范德華力與胰蛋白酶相互作用，諾氟沙星和鹽酸環丙沙星通過氫鍵及疏水相互作用與胰蛋白酶相互作用；2-氨基苯丙噻唑、諾氟沙星和鹽酸環丙沙星、蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素都能引起胰蛋白酶靜態猝滅，而油酸鈉使胰蛋白酶發生動態猝滅；此外，研究還發現蘆丁、槲皮素、山奈酚、芹菜素與胰蛋白酶形成復合物能提高胰蛋白酶的熱穩定性和pH值穩定性；而胰蛋白酶對上述類黃酮的抗氧化作用起到抑制效果[1-6]。以上對于小分子與胰蛋白酶相互作用的研究多通過熒光光譜法和紫外光譜法，用紅外光譜研究其相互作用并不多見，另外，由以上研究看出小分子多使胰蛋白酶發生靜態猝滅，與胰蛋白酶的結合主要作用力為疏水作用力、氫鍵和范德華力。

大量流行病學研究證明食物中的花色苷和植物多酚對人類許多疾病有預防和治療作用。目前，對花色素生理功能的研究集中在抗突變、抗氧化、抗腫瘤、保肝護肝等[7-9]，而作為胰蛋白酶抑制劑的研究未見報道。近年來胰蛋白酶抑制劑已引起了醫學界的普遍關注，它對急慢性胰腺炎、肺氣腫、出血性休克、腦水腫、腫瘤[10]等疾病有一定的療效；在心臟外科手術方面，能夠防止凝血異常，杜絕手術過程中的意外情況。目前，對上述疾病的處理通常是疾病發生后用蛋白酶抑制劑類藥品治療，而不是日常生活中通過飲食預防。因此根據紫甘薯花色素對胰蛋白酶的抑制作用，通過食用紫甘薯食品對患有消化系統疾病的患者進行日常調節與控制，這對消化系統處于亞健康的人有重要意義。

本研究利用紫外吸收光譜、熒光光譜和紅外光譜對紫甘薯花色素與胰蛋白酶的相互作用進行探究，分析花色素對胰蛋白酶的抑制能力，探討它們相互作用的規律，以期為紫甘薯花色素在食品、醫藥保健行業中更合理有效的利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯花色素 湖北紫鑫生物科技有限公司。

胰蛋白酶、酪蛋白 合肥Biosharp公司；其他試劑均為國產分析純，所有溶液都用二次去離子水配制并用Tris-HCl緩沖液保持生理pH值。

1.2 儀器與設備

UV1700紫外-可見分光光度計、BL-620S電子天平 日本島津公司；F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司；NEXU S型紅外光譜儀 美國Nicdet公司；Beta2-8LD真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 花色素對胰蛋白酶活性的影響及抑制類型判斷

取一定量的花色素和胰蛋白酶溶液，在不同反應條件下，測定反應前后胰蛋白酶的催化活性，探討在37 ℃、pH 7.4條件下不同反應時間、花色素濃度比例對胰蛋白酶催化活性的影響。

胰蛋白酶活性的測定方法：1 mL胰蛋白酶液和2 mL 2 g/100 mL酪蛋白溶液在37 ℃水浴中保溫10 min后，把酪蛋白加到胰蛋白酶液中，在37 ℃條件下酶解反應一段時間后，加入三氯乙酸終止反應。酶解溶液在3 000 r/min離心10 min，取上清液0.8 mL于具塞試管中，加入2 mL福林-酚溶液和3 mL pH 5.0乙酸緩沖液，在37 ℃水浴中顯色10 min，在660 nm波長處測定吸光度。

1.3.1.1 花色素濃度對胰蛋白酶活 性的影響

根據上述胰蛋白酶活性測定方法在反應體系胰蛋白酶液中加入2 mL不同濃度梯度的花色素溶液，設置酶解反應為15 min，測定660 nm波長處吸光度。抑制率按如下公式（1）計算。

式中：A空白為空白組吸光度；A樣品為加入胰蛋白酶后吸光度。

1.3.1.2 反應時間對胰蛋白酶活性的影響

根據上述胰蛋白酶活性測定方法在反應體系胰蛋白酶液中加入2 mL質量濃度為0.014 3 g/mL的花色素溶液，設置不同酶解反應時間為5、15、30、60 min，測定660 nm波長處吸光度，并按1.3.1.1節式（1）計算抑制率。

1.3.1.3 抑制類型判斷

抑制類型判斷：根據上述胰蛋白酶活性測定方法在含有2 g/100 mL酪蛋白底物的反應體系中，不加花色素溶液，設置酶解反應時間15 min，分別加入3 種濃度的胰蛋白酶液，測定660 nm波長處的吸光度，以v對胰蛋白酶液濃度（[En]）作圖，得到一條直線。按此方法，加入確定濃度的花色素溶液再作圖，最終得到兩條直線，以此判斷抑制類型是否可逆。

可逆抑制類型判斷：根據上述胰蛋白酶活性測定方法在反應體系胰蛋白酶液中加入2 mL某一確定濃度的花色素溶液，設置酶解反應為15 min，分別加入質量濃度為4、2、1、0.5 g/100 mL的酪蛋白底物，測定660 nm波長處吸光度。根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，固定酶和樣品濃度改變底物濃度測反應速率，以1/v和1/[S]作圖，得到兩條直線，來判斷可逆類型。

1.3.2 紫外吸收差譜

于2.0 mL 5×10－6mol/L的胰蛋白酶溶液中加入不同微量體積的1.0×10－3mol/L花色素溶液，使花色素與胰蛋白酶的終物質的量比分別為0、0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，混合均勻后室溫作用30 min，以相同濃度的胰蛋白酶溶液作空白，記錄胰蛋白酶溶液的紫外吸收差譜。

1.3.3 熒光光譜

于2.0 mL 5×10－6mol/L的胰蛋白酶溶液中加入不同體積的1.0×10－3mol/L花色素溶液，混和均勻后作用5 min，以λex=280 nm波長激發，在熒光光譜儀上記錄胰蛋白酶溶液的熒光發射光譜變化。

1.3.4 紅外光譜

將胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶與花色素的樣品混合溶液（胰蛋白酶濃度為5×10－6mol/L，花色素濃度為1.5×10－3mol/L）冷凍干燥，凍干后的粉末放在干燥器中待測。通過KBr壓片法，得到胰蛋白酶及混合體系的紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 酶學性質

2.1.1 花色素濃度對胰蛋白酶活性的影響

圖1 花色素加入量對胰蛋白酶活性的抑制作用Fig.1 Effect of anthocyanins concentration on trypsin activity

類黃酮類化合物與酶蛋白結合能抑制胰蛋白酶的催化活性，抑制作用與化合物的分子結構和濃度、酶蛋白的氨基酸組成及構型等密切相關[11]。如圖1所示，花色素對胰蛋白酶的催化活性具有明顯的抑制作用。隨著花色素濃度比例的增加，其對胰蛋白酶活力的抑制率也明顯增加。當花色素濃度繼續增加到0.03 mmol/L（花色素與胰蛋白酶物質的量比約為14∶1），其對酶活性的抑制效果的增幅變緩。花色素添加量為0.3 mmol/L（花色素與胰蛋白酶物質的量比約為140∶1）時，對胰蛋白酶的催化活性抑制率達到38.61%。

2.1.2 反應時間對胰蛋白酶活性的影響

圖2 反應時間對胰蛋白酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction time on trypsin activity

如圖2所示，隨著反應時間的增加，花色素對胰蛋白酶催化活性的抑制作用并沒有發生明顯的變化，說明花色素和胰蛋白酶能很快完成反應。

2.1.3 花色素對胰蛋白酶抑制類型的判斷

圖3 花色素對胰蛋白酶的抑制作用機理判斷Fig.3 Determination of the inhibitory mechanism of anthocyanins on trypsin

圖4 花色素對胰蛋白酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數曲線Fig.4 Lineweaver-Burk plots of anthocyanins for the inhibition of trypsin

根據抑制劑與酶的作用方式，以及抑制劑對酶的作用是否可逆，可將抑制劑作用分為不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用兩大類；根據可逆抑制劑與底物的關系，可逆的抑制作用可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制。黃酮類化合物與酶蛋白結合，結合到酶的活性部位表現為競爭性抑制，結合到非活性部位表現為非競爭性抑制[11-12]。觀察圖3，加入花色素后直線斜率改變，而不是向右平移，推斷花色素對胰蛋白酶的抑制作用是可逆的[13]。由圖4可知，米氏常數隨抑制劑質量濃度的增大而增大，最大反應速率保持不變。根據競爭性抑制動力學方程分別可求得花色素在不同加入量下表現的抑制常數Ki=6.16×10－4mmol/L，花色素對胰蛋白酶的抑制類型是可逆競爭性抑制。

2.2 花色素作用胰蛋白酶后的紫外吸收光譜

由圖5可知，隨花色素濃度的升高，胰蛋白酶在220 mn附近處的吸收峰增強并發生紅移。近紫外區（200～400 nm）的紫外吸收是共扼體系中：π（成鍵軌道）→π*（反鍵軌道）電子躍遷或非共軛體系中的n（孤對電子）→π*（反鍵軌道）引起的。蛋白質肽鍵有部分雙鍵性質，使發生幾率較小的n（氮上的孤對電子）→π*躍遷更加難發生，因此胰蛋白酶220 nm附近的紫外吸收峰推測是由于肽鍵C=O基團的π→π*躍遷所引起[14]，與蛋白質的α-螺旋有關。花色素引起胰蛋白酶紫外吸收峰強度增加和紅移的實質是：胰蛋白酶α-螺旋含量降低且π（成鍵軌道）→π*（反鍵軌道）電子躍遷能量差變小，電子躍遷幾率增加。

圖5 不同濃度花色素作用胰蛋白酶后的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorption spectra of trypsin after treatment with anthocyanins at various concentrations

2.3 花色素作用胰蛋白酶后的熒光光譜

2.3.1 花色素對胰蛋白酶熒光的猝滅效應

圖6 不同濃度的花色素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應Fig.6 Fluorescence quenching of trypsin by anthocyanins at various concentrations

蛋白分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸均有熒光產生，色氨酸的熒光最強，酪氨酸次之，苯丙氨酸最弱（熒光強度比為100∶9∶0.5）[15]，因此本研究主要探討色氨酸的熒光變化。由圖6可知，隨著花色素濃度增大，胰蛋白酶熒光光譜發生了熒光峰位移和熒光猝滅。熒光猝滅說明色氨酸的空間位置發生了改變[16]，而熒光峰從339 nm紅移到366 nm，說明色氨酸周圍微環境發生改變，由疏水變得更加親水[17]。

2.3.2 花色素與胰蛋白酶相互作用的熒光猝滅機理與結合常數

熒光猝滅是由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起的熒光強度降低的現象。熒光猝滅的機制主要有兩種：靜態猝滅和動態猝滅，猝滅機制都可用Stern-Volmer方程描述[18]：

式中：F0和F分別是加入猝滅劑前后熒光強度；[Q]是猝滅劑濃度；τ0為生物分子的熒光壽命，約10 ns[19]；Kq為雙分子碰撞猝滅常數（又稱表觀猝滅常數）；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數，且Ksv=Kqτ0，作花色素對胰蛋白酶猝滅的F0/F～[Q]曲線，見圖7。

圖7 花色素對胰蛋白酶熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.7 Stem-Volmer plots of fluorescence quenching of trypsin by anthocyanins

求得花色素對胰蛋白酶的表觀猝滅常數Kq為1.73×1012L/（mol·s）（304 K）、1.91×1012L/（mol·s）（300 K）遠大于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞常數2.0×1010L/（mol·s）[19]，此外，Ksv分別為1.73×104L/mol（304 K）、1.91×104L/mol（300 K），猝滅常數Ksv隨著溫度的升高而降低，因此推斷花色素對胰蛋白酶的熒光猝滅并不是由于分子擴散進而發生動態碰撞引起的動態猝滅，而是花色素與胰蛋白酶形成締合物而引起的靜態猝滅。

在靜態猝滅中，熒光體的熒光強度與其游離濃度成正比，則有[19]：

以lg[（F0－F）/F]對lg[Q]作線性擬合（圖8），即可求出花色素與胰蛋白酶的結合常數KA和結合點數n。

圖8 lg[（F0-F ）/ ]與lg[Q]的關系圖Fig.8 Plot of lg[(F0－F)/F] vs lg[Q]

由圖8求出KA為3.88×104L/mol（304 K），n為 0.86（304 K），結果表明花色素與胰蛋白酶只有一個結合位點。

2.3.3 花色素與胰蛋白酶相互作用的熱力學參數和作用力

熱力學參數和小分子與蛋白質之間作用力的關系如下[18]：

為確定花色素與胰蛋白酶之間相互作用力類型，同時研究了300 K條件下花色素對胰蛋白酶的熒光猝滅作用，并求出K=5.92×104L/mol。由式（4）可得ΔH =－80.14 kJ/mol，由式（5）和式（6）可得ΔG=－26.71 kJ/mol，ΔS =－175.75 J/mol。根據Ross等[20]總結出判斷生物大分子與小分子結合力性質和生物大分子自身結合力性質的熱力學規律，以小分子與生物大分子反應的熱力學參數的變化判斷小分子與蛋白質之間的主要作用力類型的規律。即當ΔS＞0，ΔH＞0為典型的疏水作用力；ΔS＜0，ΔH＜0為氫鍵和范德華力；當ΔS＞0，ΔH＜0時，主要存在靜電相互作用。因此，花色素與胰蛋白酶的結合是熵減少、自由能降低的自發過程（ΔG＜0），又因為ΔS＜0，ΔH＜0所以花色素與胰蛋白酶分子間作用力主要表現為氫鍵和范德華力。

2.3.4 花色素與胰蛋白酶結合的距離

蛋白質的內源熒光主要是色氨酸殘基產生的，因此根據F?rster能量轉移理論[21]可計算出小分子在蛋白質上的結合位置與色氨酸殘基之間的距離r，即兩種化合物滿足：1）供能體發熒光；2）供能體的熒光發射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊；3）供能體與受能體的最大距離不超過7 nm。

在實驗中，根據胰蛋白酶的熒光發射光譜和花色素的紫外吸收光譜的重疊圖譜（圖9），應用下列公式[22]計算胰蛋白酶與花色素之間的結合距離r：

式中：F0和F分別是胰蛋白酶和花色素-胰蛋白酶（物質的量比1∶1）的熒光；R0是E = 50%時的臨界距離；K2為偶極空間取向因子；N為介質的折射指數；Φ為供體胰蛋白酶的熒光量子產率；J為供體胰蛋白酶熒光光譜與受體花色素吸收光譜的重疊積分；Fλ為熒光供體在波長λ處的熒光強度；ελ為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。

根據公式求得花色素與胰蛋白酶的重疊積分J= 8.71×10－14cm3/mol，R0=3.52 nm，E=0.48。花色素和胰蛋白酶之間的結合距離r=3.56 nm。由于r＜7 nm，且0.5 R0＜r＜1.5 R0，因此推斷花色素和胰蛋白酶發生了F?rster偶極-偶極非輻射能量轉移，并引起了熒光猝滅，表明花色素與胰蛋白酶發生締合。

圖9 花色素的吸收光譜（a）和胰蛋白酶的熒光光譜（b）Fig.9 UV-visible absorption spectrum of anthocyanin (a) and fluorescence emission spectrum of trypsin (b)

2.4 花色素作用胰蛋白酶后的紅外光譜

圖10 花色素-胰蛋白酶的紅外光譜Fig.10 FT-IR spectra of trypsin alone and in the presence of anthocyanins

通過紅外光譜可以定量地確定蛋白質的結構含量變化。由圖10可知，花色素與胰蛋白酶相互作用后1 640 cm－1峰和1 543 cm－1峰位置均發生位移，說明花色素與胰蛋白酶發生了相互作用，使胰蛋白酶的二級結構發生了變化，這可能是由于花色素與胰蛋白酶分子中的C=O和C—N或N—H基團發生了相互作用[23]，也可能是花色素與蛋白質分子的多肽鏈之間形成了氫鍵。

圖12 胰蛋白酶（A）及花色素-胰蛋白酶（B）去卷積譜的曲線擬合結果Fig.12 Fitting curves of amide I (1 700-1 600 cm－1) of free trypsin (A) and anthocyanins-trypsin complex (B)

根據蛋白質酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm－1）譜峰歸屬[24]：1 610～1 640 cm－1為β-折疊；1 640～1 650 cm－1為無規則卷曲；1 650～1 658 cm－1為α-螺旋；1 658～1 695 cm－1為β-轉角。將得到的紅外光譜二階導數、去卷積處理，把酰胺Ⅰ帶中未能分辨的峰進一步分解為多個子峰，并指認各子峰位置，再通過曲線擬合的方法，定量地分析胰蛋白酶二級結構的各個組分。圖11和圖12表示了花色素-胰蛋白酶體系的二階導數譜、去卷積譜和曲線擬合結果。通過圖12中各譜峰峰面積的比值可得花色素對胰蛋白酶二級結構的影響變化值（表1）。加入花色素后，胰蛋白酶構象中α-螺旋、β-轉角和無規則卷曲含量分別減少6.6%、11.1%和5.0%，β-折疊含量增加了21.7%，說明花色素與胰蛋白酶發生了相互作用，使胰蛋白酶主要構象β-折疊含量升高。

表1 胰蛋白酶及花色素-胰蛋白酶的二級結構含量Table1 Secondary structure contents of free trypsin and anthocyaninstrypsin complex

3 結 論

紫甘薯花色素對胰蛋白酶活性存在可逆的競爭性抑制作用；二者之間發生了相互作用，且主要作用力為氫鍵和范德華力；花色素通過靜態猝滅和能量轉移的方式使胰蛋白酶內源熒光減弱；二者相互作用后胰蛋白酶二級結構發生了變化，主要構象β-折疊含量增加。在本研究基礎上，還可通過圓二色譜和分子模擬進一步探討花色素對胰蛋白酶二級結構影響以及二者的結合位置。

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Interaction between Purple Sweet Potato Anthocyanins and Trypsin

LIU Shuo, WANG Meng, ZHU Shao-hua, JIANG Hong, LI Xiao-ding*
(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The interaction between purple sweet potato anthocyanins and trypsin was studied by measuring the catalytic activity and reaction kinetics through ultraviolet (UV) absorption, fluorescence and infrared (IR) spectroscopy. The results showed that purple sweet potato anthocyanins had an obvious inhibitory effect on trypsin catalytic activity, and the inhibition was reversible competitive inhibition with an inhibitory constant (Ki) of 6.16 × 10-4mmol/L. When the r eaction between purple sweet potato anthocyanins and trypsin with a mole ratio of 140:1 was carried out at 37 ℃ for 15 min, the inhibitory rate was 38.61%; however, the catalytic activity was not obviously affected by reaction time. Purple sweet potato anthocyanins treatment led to the quenching of intrinsic fluorescence of trypsin. The quenching of trypsin by purple sweet potato anthocyanins was probably a static quenching process with a quenching constant (Kq) of 1.73×1012L/(mol s), and a binding constant (KA) of 3.88×104L/mol. The number of binding sites was 0.86. According to the thermodynamic parameters, hydrogen bonding and van der Waals force played a dominant role in the interaction between the anthocyanins and trypsin. The distance between donor and acceptor in anthocyanin-trypsin was calculated as 3.56 nm, based on the equations from F?rster non-radiation energy transfer theory. The IR spectra revealed the conformational change of trypsin caused by binding, thus leading to a decrease of α-helix and an increase of β-fold.

purple sweet potato anthocyanins; trypsin; enzym atic properties; ultraviolet (UV) absorption spectroscopy; fluorescence spectroscopy; infrared (IR) spectroscopy

TS201.2

A

1002-6630（2014）23-0232-06

10.7506/spkx1002-6630-201423045

2014-01-07

劉碩（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：liushuo@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：李小定（1968—），男，副教授，博士，研究方向為糧食油脂與植物蛋白工程、天然產物化學。E-mail：lixd@mail.hzau.edu.cn