漿水中微生物的分離與鑒定

李雪萍，李建宏，孟憲剛，鄭 楠，謝佳佳

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

漿水中微生物的分離與鑒定

李雪萍，李建宏，孟憲剛*，鄭 楠，謝佳佳

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

以漿水為實驗材料，在多種培養基平板上分離純化其中的微生物，共得到24 株菌，其中細菌20 株，絲狀真菌3 株，酵母菌1 株。對純化后的各菌株進行菌落形態觀察、革蘭氏染色、生化特性研究以及分子生物學鑒定，結果表明：漿水中存在多種微生物，其細菌以乳桿菌屬或雙歧桿菌屬等益生菌為主，酵母菌為釀酒酵母，絲狀真菌為變灰青霉和橘青霉。結果說明漿水微生物組成優良，具有開發利用潛力，但其中還存在雜菌和有害菌，應在生產中引起進一步重視。

漿水；微生物；分離；鑒定

近30年來，我國國民經濟實現了飛躍式發展，人民生活水平得到了極大的提高，飲食結構也相應發生了變化，富含脂肪、膽固醇等物質高營養、高熱量的食物越來越多的被人們食用，與之相隨，動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病的發病率也在逐年增高，有統計顯示其已成為我國引起死亡的主要疾病。而有研究發現[1]，發酵蔬菜制品在降低膽固醇，預防心腦血管疾病方面有卓越的性能。因此，傳統發酵蔬菜受到了人們的重視，其中一些種類實現了工業化、標準化的生產，如韓國泡菜、日本泡菜等。近年來，我國在這一領域也有了突飛猛進的發展，據中國調味品協會的統計，目前我國發酵蔬菜的年產值已超過150億元，且連續三年保持了20%～30%的增長率[2]。在此趨勢帶動之下，一些富于我國地方特色的發酵蔬菜被越來越多的學者所關注，如在西北地區的廣受歡迎的發酵食品漿水，近年來就有學者對其進行了研究，呂嘉櫪等[3]研究了漿水的發酵工藝，張培等[4]研究了漿水中有機酸的含量，這些研究為漿水的進一步深入研究乃至實現工業化的生產奠定了理論基礎。但是，相對于其他發酵蔬菜，漿水的研究及開發仍顯落后，尤其作為基礎性的微生物分離鑒定工作，前人研究的較少且較粗造，成為了漿水研究工作中的薄弱環節，也是實現標準化生產進程中的瓶頸因素。因此，對漿水中可培養微生物進行分離鑒定就是一項非常必要而迫切的工作，其不僅對于漿水的開發有重要作用，而且對豐富我國發酵蔬菜種類、豐富人民餐桌具有積極意義。

本研究選擇以甘肅慶陽環縣為采樣地點，該地區食用漿水的歷史悠久，制作工藝較為成熟，且該地區氣候特征為西北典型的溫帶大陸性半干旱氣候，因此，采樣地點具有代表性。分離純化漿水中的微生物，并結合生理生化法和分子生物學方法鑒定其種屬，旨在為進一步選育優良益生菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漿水：采自甘肅省慶陽市環縣木缽鎮吳家墩村，取樣時參考當地食用習慣，在芹菜漿水處于風味最佳的階段（無泡沫、味酸、漿水清澈、口感清爽[5]）時取樣，取得樣品后，貯存于無菌容器，低溫運輸至實驗室，立即分離。

細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 北京百泰克生物技術有限公司；HP Fungal DNA Kit（離心柱型） 美國Omega公司；2 000 bp DNA Ladder 美國Biomiga公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl dulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Tris-飽和酚美國Sigma公司；瓊脂糖、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司；β-巰基乙醇（分析純） 天津市精細化工研究所；異戊醇（分析純） 上海中秦化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano Drop 2000紫外分光光度計 美國賽默飛世爾科技公司；2500凝膠成像儀、HE-120電泳儀 上海天能科技有限公司；Sorvall legend RT離心機 美國Kendro公司；MyCycler PCR儀 美國伯樂公司；Centrifuge 5418R臺式離心機、各型加樣槍 德國艾本德公司。

1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基、YPD培養基、醋酸菌篩選培養基、查氏培養基、MRS培養基、M17培養基、TYC培養基。

1.4 方法

1.4.1 菌株分離

將漿水在無菌條件下分別稀釋至合適濃度（稀釋度以平板表面出現單菌落為度），在1.3節所示7 種培養基上用平板涂布法分離單菌落，恒溫培養（細菌37 ℃培養，酵母菌30 ℃培養，絲狀真菌25 ℃培養），細菌和酵母菌用平板劃線法純化，絲狀真菌用單孢子分離法純化。鏡檢，挑選在平板上菌落形態一致、在顯微鏡下細胞形態一致的菌株作為實驗菌株；兼性厭氧菌采用改良的焦性沒食子酸法培養[6]。

1.4.2 菌落形態及細胞形態的觀察

將已純化的菌株活化后，接種在相應的培養基上進行培養，培養至24～48 h時觀察并記錄菌落形狀、色澤、隆起、表面平整度、邊緣形狀等；細菌采用涂片法，培養至24～36 h時取樣涂片，用三步法做革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形狀和顏色（分別用Staphyloccocus aureus和Escherichia coli做陽性和陰性對照）；酵母菌用水浸片法觀察；絲狀真菌采用插片法在40 倍顯微鏡下取樣觀察，并根據《真菌鑒定手冊》[7]、《常見與常用真菌》[8]、《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]查詢各真菌的分類地位。

1.4.3 生化特性的研究

將已純化的各細菌活化后分別進行如下實驗：接觸酶反應實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、石蕊牛奶實驗、糖發酵實驗、硫化氫產生實驗、吲哚產生實驗、乙酰甲基甲醇（V-P）實驗，準確觀察并記錄實驗結果。根據菌落形態、革蘭氏染色結果及生化特性研究結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[10]、《常見細菌系統鑒定手冊》[11]查詢各細菌的分類地位。

1.4.4 細菌及酵母的分子鑒定

1.4.4.1 DNA的提取

細菌用細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取；酵母菌的基因組DNA用HP Fungal DNA Kit提取。

1.4.4.2 DNA純度及濃度檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測。

1.4.4.3 引物設計與合成

細菌：擴增引物為細菌16S rDNA擴增通用引物27F-1492R，序列分別為：27F：5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’，由北京華大基因研究中心合成。

酵母菌：擴增引物為真核生物18S rDNA擴增通用引物NS7和NS8，引物序列分別為：NS7：5’-GCAATAACAGGTCTGTGATGC-3’，NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’，由北京華大基因研究中心合成。

1.4.5 擴增反應

擴增反應在梯度PCR儀上進行PCR反應，細菌PCR擴增反應體系為（25 μL）：10×Buffer緩沖液2.5 μL，10 mmol/L Mg2+1.5 μL，25 mmol/L dNTP 0.5 μL，20 μmol/L PCR引物各0.5 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.25 μL，25 ng/μL的模板DNA各2 μL，無菌雙蒸水稀釋至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s，重復擴增40 個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

酵母菌PCR擴增反應體系（20 μL）：超純水13.4 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTP 0.3 μL，引物各1 μL，Taq酶0.3 μL，模板DNA 2 μL。反應條件分別為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s、51 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min，共30 個循環，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.6 擴增產物的檢測與測序

反應產物檢測通過瓊脂糖凝膠電泳法完成，DNA Marker為2 000 bp DNA Ladder，將擴增出的產物的測序直接交華大基因公司完成。

1.4.7 序列分析

使用軟件D N A M A N 4.0進行序列分析；利用CLUSTALX（1.83）對序列分別進行比對；在CLUSTAL中實現“掐頭去尾”；在BLAST獲得相似序列。

1.4.8 系統進化樹的構建

在GenBank獲得與實驗菌株親緣較近的菌株16S rDNA序列作為參比，用Clustalx1.83進行序列比對，使用MEGA 5.1.2構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株分離

從漿水中共分離出24 株菌，其中細菌20 株，真菌4 株。

2.2 各菌株菌落形態及顯微形態

表1 細菌菌落形態及革蘭氏染色結果Table1 Colonial morphology and results of Gram staining of the bacteria

細菌菌落形態觀察結果（表1）顯示，本研究所分離的細菌菌落均為圓形，白色至淡黃色，大多表面光滑，呈現典型的細菌菌落特征。革蘭氏染色顯微觀察結果顯示所分離菌大多為桿菌，少數為球菌。

2.3 生化特性研究

表2 細菌及酵母菌的生化特性Table2 Biochemical characteristics of the bacteria and the yeast

由表2可知，以接觸酶反應，淀粉水解反應等10 項指標對所分離微生物進行鑒定，其結果和《伯杰細菌鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》及《酵母菌的特征與鑒定手冊》中的描述符合性良好，說明了本研究實驗準確，從而保證了鑒定結果的可靠性。

2.4 基因組DNA濃度和純度分析

圖1 供試細菌（A）和酵母菌（B）菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of genomic DNA from the experimented strains of bacteria (A) and yeast (B)

如圖1所示，所提取的基因組DNA經0.8%的瓊脂糖電泳、凝膠成像系統下觀察，可以清晰地看到基因組DNA大小約為23 kb，且加樣口無亮光，帶型完整，無拖尾現象。通過紫外分光光度計測定OD260nm、OD280nm并計算出OD260nm/OD280nm的值在1.8～2.0，計算得DNA質量濃度為在40～80 ng/L，并結合電泳圖譜得出所提DNA純度較高，RNA和蛋白質含量較少，無降解。綜上，表明所提DNA完整性好，純度高，符合后續研究要求。

2.5 擴增產物電泳檢測

圖2 供試細菌（A）和酵母菌（B）16S rDNA/18S rDNA區擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplified 16S rDNA/18S rDNA of the experimented strains of bacteria (A) and yeast (B)

由圖2可知，通過選用原核生物通用引物進行各細菌DNA PCR擴增反應，擴增出了菌株的16S rDNA區序列，目的片段在1 000～2 000 bp之間，與預期在1 400 bp左右相一致；用真核生物通用引物進行酵母DNA PCR擴增反應，擴增出了菌株的18S rDNA區序列，目的片段在250～500 bp之間，與預期在350 bp左右相一致；條帶清晰明亮，沒有出現彌散帶和其他雜帶，完整性較好。

2.6 各菌株的鑒定結果

2.6.1 絲狀真菌的鑒定結果

表3 真菌的形態特征及鑒定結果Table3 Morphological characteristics and identifications of the fungi

如表3所示，本研究分離出的絲狀真菌種類較少，只有橘青霉和變灰青霉兩種，這兩種菌都常見于一些腐爛的食品，如糧食、肉類、水果、蔬菜等，另外也是紡織物和皮革霉爛的主要微生物，是工業、農業生產中的主要病害真菌。但近些年來，這兩種菌也逐漸成為工業生產中的重要菌種，例如用于核酸酶P1[12]、醛酮氧合酶[13]、脂肪酶[14]、果糖氧化酶[15]的生產等。然而在漿水中出現這兩種菌，會加速漿水的腐敗變質，是一種有害菌，分析其原因可能是菜品選擇不嚴格造成的，從一個側面反映了作坊式生產方式的弊端。

2.6.2 酵母菌的鑒定結果

結合形態鑒定、生理生化鑒定以及分子生物學鑒定等結果，菌株FQ4鑒定為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，和前人研究得出的結果類似[5,16-17]。釀酒酵母是人類應用最早的微生物資源，安全性和其他優良特性得到了充分的驗證和肯定[18]。漿水中的釀酒酵母可以起到改善漿水風味的作用。

2.6.3 細菌的鑒定結果

細菌的生理生化和分子生物學實驗鑒定結果見表4。

表4 細菌的生理生化和分子生物學鑒定結果Table4 Identification of the bacteria

圖3 細菌系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the bacteria

由鑒定結果（表4）可知，本研究所采用的兩種鑒定方法其鑒定結果吻合良好，二者互相印證，說明了鑒定結果的準確。如圖3所示，從系統發育學的角度，本研究分離出的16株細菌的16S rDNA序列與GenBank中序列的自展支持率在98%以上，可以確定為10個屬。分離到的微生物中，大多都是乳酸菌，如乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、明串珠菌屬、戊糖乳桿菌、馬里乳桿菌、德氏乳桿菌、發酵乳桿菌、植物乳桿菌、消化乳桿菌等，大量的研究證據都顯示這些菌的某些株系在發酵蔬菜中具有兩個方面的優良性能，一是具有益生功效[19]，如促進胃腸道健康、促進膽固醇降解、增強免疫力延緩衰老等。二是改善了蔬菜品質，如改善蔬菜風味[20]、提高蔬菜安全[21-22]、提高蔬菜營養價值[23]等。另一方面，例如戊糖乳桿菌等除了上述兩個方面的作用外，在一定條件下更能產生戊糖乳桿菌素等細菌素是良好的生物保鮮劑，其具有抗菌保鮮作用且對人體無毒副作用，可以防止漿水的霉變腐敗，可改善食品質量和食品安全的天然化合物，具有作為食品生物防腐劑的潛在應用價值[24-25]。綜上，由鑒定結果可以從微生物學的角度說明漿水確實是一種非常具有開發利用前景的優良發酵蔬菜類食品。

但同時，由鑒定結果還可以發現除益生菌外，漿水中還含有一些有害菌，如霉菌、大腸彎曲桿菌等，這些菌或者影響漿水的貯存，或者危害人類的健康，因此，本課題組應該努力避免雜菌的存在。另外，還說明漿水在生產過程中還存在比較嚴重的問題，也反映出傳統的生產方式不利于漿水的產業化。

3 討 論

本研究的結果在說明漿水具有巨大開發利用前景的同時，也從一個側面反應了漿水生產過程中存在許多問題，而這些問題歸結起來就是生產方式粗放、管理模式落后造成的，而要將漿水做成一個產業，則必須要很好的解決這些問題，這就要求科研工作者認真探索漿水生產的每一個環節，例如優良菌種、最佳菜品、最佳工藝等，以菜品選擇為例，傳統漿水發酵的主要蔬菜是芹菜和圓根菜，然而有研究表明，這兩種菜品并不利于乳桿菌等一些益生菌的生長，而白蘿卜、黃瓜、山藥、胡蘿卜等一些蔬菜對益生菌的生長卻有很好的促進作用[26-27]。因此，這就要求在研究是要革新傳統生產方式，這樣才能真正將漿水做大做強。

本研究分離到的細菌中，有戊糖乳桿菌等產細菌素的菌株，而近些年來的研究提示，細菌素可以作為生物保鮮劑[28-29]，這一特性正好彌補了化學保險劑會引起食品安全問題的缺點。產細菌素的益生菌可以制成生物保鮮菌劑，將之運用于蔬菜的加工，可以有效提高原材料、生產過程及產品的安全性，延長發酵蔬菜產品的貨架期，同時還避免了化學添加劑。符合人民群眾對健康食品的需求。是改善發酵食品質量、提高安全性的重要手段和研究方向[30]。

另外，在漿水生產工藝方面，還可以借鑒其他發酵蔬菜制品的先進經驗以提高高其質量，例如近年來發展的低溫發酵技術[31]、原材料超高壓滅菌技術[32-33]、產品熱處理技術[34]等，唯有廣泛吸收先進經驗的基礎上，用于實踐和探索，漿水才能真正走出西北、走向全國乃至全世界，形成產業優勢。

4 結 論

由研究結果可以看出，實驗所用漿水樣本中存在多種微生物，囊括細菌、酵母以及絲狀真菌，相對而言以細菌為主體，且其大多為乳桿菌屬或乳球菌屬，另外還含有能改善發酵風味的釀酒酵母。從微生物學的角度是一種非常具有開發利用潛力的優良發酵蔬菜類食品；但另一方面，研究發現漿水中還存在霉菌和腸道菌等有害菌的污染，不利于漿水的發酵和保存，分析其原因主要是由漿水制作中的不規范造成的，也說明進行標準化、規范化生產的必要性。

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Isolation and Identification of Microorganisms from Jiangshui, a Traditional Chinese Fermented Vegetable Product

LI Xue-ping, LI Jian-hong, MENG Xian-gang*, ZHENG Nan, XIE Jia-jia
(School of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, China)

In this study, 24 strains were isolated from Jiangshui, a traditional Chinese fermented celery product, and purified by various culture medium plates, including 20 strains of bacteria, 3 strains of filamentous fungi, and 1 strain of yeast. The purified strains were analyzed through morphological, Gram staining, biochemical characteristics and molecular biology identification. The results showed that various microorganisms existed in Jiangshui, and the bacteria mainly belonged to the genera Lactobacillus or Bifidobacterium. The yeast was Saccharomyces cerevisiae, and the filamentous fungi were Penicillium canescens and Penicillium citrinum. These results illustrate that the composition of microorganisms is excellent, with a good potential for development and utilization. But there are also some miscellaneous bacteria and harmful bacteria, which should be taken seriously in production.

Jiangshui; microorganism; isolation; identification

TS201.3

A

1002-6630（2014）23-0204-06

10.7506/spkx1002-6630-201423040

2014-01-05

2012甘肅省財政廳生物專項（213001）；2011甘肅省財政廳高等學校基本科研業務費項目（211135）

李雪萍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。E-mail：lixueping0322@126.com

*通信作者：孟憲剛（1974—），男，教授，博士，研究方向為食品發酵工程 。E-mail：mengxg@mail.lzjtu.cn