自然發酵蘋果渣中的微生物區系分析

孫文靜，陳義倫，吳茂玉，王鳳忠，黃坤勇，朱宇竹，周 波,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究 院，山東 濟南 250014；3.中國農業科學院 農產品加工研究所，北京 100193；4.中寧牧光生物 科技有限公司，寧夏 中衛 755100）

自然發酵蘋果渣中的微生物區系分析

孫文靜1，陳義倫1，吳茂玉2，王鳳忠3，黃坤勇4，朱宇竹1，周 波1,*

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究 院，山東 濟南 250014；3.中國農業科學院 農產品加工研究所，北京 100193；4.中寧牧光生物 科技有限公司，寧夏 中衛 755100）

以自然發酵的蘋果渣為對象，采用選擇平板分離技術，對其不同層次的微生物區系組成進行分析。通過形態學觀察、生理生化測定，結合ITS區、26S r RNA和16S r RNA基因序列分析等多 相分類法對分離獲得的微生物進行鑒定，研究蘋果渣不同溫度層中的微生物區系組成。結果表明：自然發酵蘋果渣中主要微生物組成為酵母菌和乳酸菌，從28、37、45、50 ℃這4 個溫度層中分離得到 10 株菌，4 個溫度層的優勢菌分別鑒定為黑曲霉、乳酸鏈球菌、馬克斯克魯維酵母和東方伊薩酵母。

自然發酵；蘋果渣；微生物區系；多相分類法

蘋果渣是蘋果加工業的副產物，主要由果皮、果核和殘余果肉組成，約占鮮果質量的25%[1]。我國是世界上蘋果生產第一大國，蘋果種植規模和總產量占世界蘋果總生產水平的1/3左右。據統計，2009年我國的年產量約達3 300萬 t，2012年產量達到3 800萬 t，約占世界蘋果總產量的63.3%[2]。近年來，隨著我國蘋果加工業的飛速發展，每年約有100多萬噸蘋果渣產生[3]。蘋果渣含有可溶性糖、氨基酸、維生素、礦物質和果酸等多種營養物質，果膠、不可溶性膳食纖維等物質含量非常豐富[4-5]。作為果汁業的主要副產品，經深加工后可提高蘋果渣的附加產值，減輕環境污染，提高企業經濟效益，是一種可以資源化利用的加工副產物。

目前，蘋果渣主要為直接干燥或發酵作飼料[6]，也用于提取果膠[7]、膳食纖維[8]及作為微生物的生長基質來生產酒精[9]、檸檬酸[10]、低聚糖[11]等，還可經微生物發酵作為生物有機肥使用。蘋果渣含有較高水分，易被微生物浸染，發霉、腐爛變質，加工利用前大量的蘋果渣在貯存備用期間會發生自然發酵現象，給其加工產品帶來安全性影響。2002年李志西等[6]曾分析過發酵蘋果渣中的微生物組成，但目前國內外對自然發酵蘋果渣的微生物區系分析的研究較少；本實驗主要以自然發酵狀態下蘋果渣為研究對象，對其進行微生物組成分析，以期闡明自然發酵蘋果渣微生物組成特征，為深入研究自然發酵蘋果渣應用的安全性，提升產業價值提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣樣品由中寧牧光生物科技有限公司提供。濃縮果汁廠加工產生的新鮮果渣（9月1日）經過約一個月（10月5日）的自然堆積發酵（厚度約1.5 m，pH 3.0～3.5），形成明顯分層。自然發酵蘋果渣的基本性質見表1。

表1 自然發酵蘋果渣的基本性質Table1 Basic properties of naturally fermented apple pomace

葡萄糖、蔗糖、無水乙酸鈉、檸檬酸銨、KNO3、NaCl、MgSO4、FeSO4（均為分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；TIANamp Yeast DNA Kit DP307試劑盒、TIANamp Bacteria DNA Kit DP302試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 培養基

真菌分離培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

細菌分離培養基（LB）：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

放線菌分離培養基（高氏Ⅰ號）：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 3.5。

真菌鑒定及保藏培養基（CA）：NaNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

乳酸菌保藏培養基（MRS）：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫-80 1.0 mL、K2HPO42.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、瓊脂20 g、碳酸鈣20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2。

1.3 儀器與設備

Nikon YS2電子顯微鏡 日本尼康光學儀器有限公司；TGL-16B離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-3C型數字式酸度計 上海理達儀器廠；HH-I數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；T-Gradient PCR儀 德國Biometra公司；GelDoc-It凝膠成像系統 美國UVP公司。

1.4 方法

1.4.1 蘋果渣中微生物組成分析[12-13]

稱取自然發酵的蘋果渣10 g于90 mL無菌水中，振蕩搖勻后進行系列稀釋，取適宜濃度分別涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ號培養基上，按分層的溫度要求倒置培養后進行菌落計數。

1.4.2 不同層次中微生物的分離與純化

不同層次微生物分離：分別稱取10 g各層次的蘋果渣于90 mL無菌水中，振蕩混勻后進行系列稀釋，取適宜濃度涂布于PDA、LB和高氏Ⅰ號培養基上，按自然發酵蘋果渣的層次溫度倒置培養。

菌種純化和保藏：挑取不同形態的菌體作平板劃線純化，將純化單一的菌體于斜面培養基上，4 ℃保藏備用。

1.4.3 菌種鑒定

對所獲得的菌株通過形態學觀察、生理生化測定，結合分子生物學基因序列分析等多相分類法進行鑒定。

1.4.3.1 形態學及顯微形態觀察

將分離所得微生物接種于對應的培養基上，進行菌落形態和顯微鏡觀察并記錄。

1.4.3.2 生理生化分析

真菌的生理生化鑒定：根據文獻[14-16]進行生理生化鑒定。主要指標包括碳源利用實驗、氮源利用實驗、明膠水解實驗和糖發酵實驗。

細菌的生理生化鑒定：根據文獻[17-18]進行生理生化鑒定。主要指標包括革蘭氏染色、過氧化氫酶實驗、葡萄糖產酸產氣實驗、淀粉水解實驗、硝酸鹽還原、明膠液化實驗和碳源利用實驗。

1.4.3.3 分子生物學鑒定

霉菌的分子鑒定：將分離純化的霉菌接種于PDA固體培養基上，倒置培養3～5 d，收集菌體至研缽中，加液氮充分研磨后，用OMEGA Fungal DNA Mini Kit D3390-01試劑盒進行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用霉菌通用引物ITS1和ITS4進行ITS區的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增[19]。

酵母菌的分子鑒定：將分離純化的酵母菌接種于PDA液體培養基中，振蕩培養18 h，用TIANamp Yeast DNA Kit DP307試劑盒進行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用酵母菌通用引物NL1和NL4進行26S rRNA的PCR擴增[20]。

細菌的分子鑒定：將分離純化的細菌接種于MRS液體培養基中，振蕩培養18 h，用TIANamp Bacteria DNA Kit DP302試劑盒進行DNA提取。以基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F和1495R進行16S rRNA的PCR擴增[21]。

將上述PCR擴增產物送至華大測序公司進行測序，測序結果在軟件DNAMAN上進行拼接，拼接結果在美國國立生物技術信息中心（National Center for BiotechnologyInformation，NCBI）中的GenBank進行BLAST比對，根據比對結果，采用MEGA5軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 自然發酵蘋果渣中微生物組成分析

采用平板稀釋涂布法，對樣品進行培養，統計得到的菌數結果為：霉菌3.5×103CFU/g、酵母菌2.5×107CFU/g、細菌1.6×107CFU/g，放線菌未檢出；由此可知自然發酵的蘋果渣中的主體微生物為酵母菌和乳酸菌，其次是霉菌，未分離到放線菌。

表2 自然發酵蘋果渣不同層次中的優勢菌株Table2 Dominant strains of different layers in naturally fermented apple pomace

由表2可知，在第一層中分離得到3 株菌株，分別編號為2-1、2-2和2-3，由菌落數可知2-1為優勢菌株，其菌落形態如圖1a所示；在第二層中分離得到4 株菌株，分別編號為3-1、3-2、3-3和3-4，由菌落數可知3-2為優勢菌株，其菌落形態如圖1b所示；在第三層中分離得到2 株菌株，分別編號為4-1和4-2，由菌落數可知4-1為優勢菌株，其菌落形態如圖1c所示；在第四層中分離得到一株菌株，編號為5-1，其菌落形態如圖1d所示。

圖1 自然發酵蘋果渣不同層次優勢菌株的菌落形態Fig.1 Colony morphology of the dominant stains from different layers in naturally fermen ted apple pomace

2.2 自然發酵蘋果渣中分離菌株的形態學鑒定

自然發酵蘋果渣分離所得菌株的形態學特征見表3。由菌落形態可知，菌株2-1、2-2、3-1和3-3在培養基上有大量菌絲，叢生，上有不同顏色的孢子；菌株2-3、3-4、4-1和5-1的菌落圓形，表面光滑濕潤，顏色呈白色或乳白色，表面凸起，有淡香味，經染色觀察為細胞圓形，出芽生殖；菌株3-2和4-2的菌落濕潤，圓形，經染色觀察為革蘭氏陽性菌，菌體呈球形，成對或成鏈存在。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]、《真菌鑒定手冊》[16]和《伯杰氏系統細菌學手冊》[18]，初步認為菌株2-1、2-2、3-1和3-3為霉菌；菌株2-3、3-4、4-1和5-1為酵母菌；菌株3-2和4-2為細菌。對分離所得的10 株菌株進行生理生化鑒定，進一步確定其分類地位。

表3 自然發酵蘋果渣中分離所得菌株的形態學特征Table3 Morphological characteristics of the strains isolated from naturally fermented apple pomace

由形態學和顯微觀察可知，菌株2-1菌落初生白色菌絲，其上密生一層黑色粉粒，邊緣不規則，菌絲頂囊球形，分生孢子灰黑色，大而呈球形，分生孢子梗光滑，小梗雙層；菌株2-2菌落白色，扁平，菌絲匍匐，叢白粉狀，分生孢子梗直立，較短，頂生長串狀的分生孢子，為圓筒形或長筒形的節孢子狀；菌株3-1菌落灰綠色，中心有少許絮狀突起，反面黃綠色，有輕霉味，分生孢子穗圓筒形，分生孢子梗光滑，頂囊燒瓶狀，分生孢子球形；菌株3-3菌落綠色，孢子叢常帶綠色，分生孢子梗有橫隔，光滑，頂端不對稱掃帚狀，分生孢子球形或橢圓形，參照《真菌鑒定手冊》[16]初步認為菌株2-1和3-1為曲霉屬，菌株2-2為地霉屬，菌株3-3為青霉屬。

2.3 生理生化鑒定

2.3.1 細菌的生理生化鑒定

表4 細菌的生理生化鑒定結果Table4 Physiological and biochemical identification of bacteria

由表4可知，菌株3-2和4-1革蘭氏染色均為陽性，葡萄糖產酸為陽性，均發酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖和甘露醇，菌株4-1還發酵阿拉伯糖和山梨醇。參照《伯杰氏系統細菌學手冊》[18]，初步認為菌株3-2為鏈球菌屬和4-2為乳桿菌屬。

2.3.2 酵母菌的生理生化鑒定

菌株2-3、3-3、4-1和5-1無菌絲和孢子，菌落形態不同于霉菌，經過顯微觀察，細胞形態為圓形或橢圓形，生殖方式為芽殖，有淡香味。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]和《真菌鑒定手冊》[16]，初步認為菌株2-3、3-3、4-1和5-1為酵母菌，對其進行生理生化實驗，結果見表5、6。

表5 酵母菌糖發酵鑒定結果Table5 Results of carbohydrate fermentation tests for yeasts

表6 酵母菌碳源同化實驗及氮源同化結果Table6 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for yeasts

由表5、6可知，菌株2-3和4-1全部發酵乳糖、蔗糖、棉子糖、葡萄糖、半乳糖和麥芽糖，不發酵蜜二糖和海藻糖；菌株3-4發酵葡萄糖、海藻糖和半乳糖，其余糖不發酵；菌株5-1只發酵葡萄糖。菌株全部同化乙醇，不同化麥芽糖和淀粉，在單一氮源培養基中全部不同化硝酸鈉和亞硝酸銨；菌株3-4可同化D-木糖；菌株2-3和4-1可同化棉子糖和乳糖。參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[15]和《真菌鑒定手冊》[16]，初步認為菌株2-3和4-1為克魯維酵母屬，菌株3-4為假絲酵母屬和菌株5-1為伊薩酵母屬。對分離得到的10 株菌株進行分子生物學分類鑒定，進一步確定其分類地位。

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 序列比對結果與分析

利用3 種試劑盒提取10 株菌株的DNA，PCR擴增后，將PCR產物送至北京華大基因進行測序，利用DNAMAN將測序結果進行拼接，拼接結果在GenBank中進行BLAST比對，挑選同緣性超過99%的基因序列。綜合形態學觀察，生理生化特征和分子生物學基因序列分析，分離所得10 株菌株的鑒定結果見表7。該菌株已被山東農業微生物菌種保藏中心（Agricultural Microbiology Culture Collection，AMCC）收錄。

表7 自然發酵蘋果渣分離所得菌株的鑒定結果Table7 Identification of the strains in naturally fermented apple pomace

2.4.2 系統發育樹的構建

PCR產物經過測序，于GenBank中進行BLAST比對，挑選同緣性超過99%的基因序列構建系統發育樹，如圖2～4所示。

圖2 分離所得細菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated bacteria

圖3 分離所得霉菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolated molds

圖4 分離所得酵母菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolated yeasts

由系統發育樹可知，菌株2-1與Aspergillus niger，菌株2-2與Galactomyces geotrichum，菌株2-3與4-1與Kluyveromyces marxianus，菌株3-1與Aspergillus fumigatus，菌株3-2與Lactococus lactis，菌株3-3與Penicillium paneum，菌株3-4與Candida tartarivorans，菌株4-2與Lactobacillus plantarum，菌株5-1與Issatchenkia orientalis的同源性最高，與比對結果基本一致。綜合形態學觀察，生理生化特征和分子生物學基因序列分析，最終確定菌株2-1為Aspergillus niger，菌株2-2為Galactomyces geotrichum，菌株2-3與4-1為Kluyveromyces marxianus，菌株3-1為Aspergillus fumigatus，菌株3-2為Lactococus lactis，菌株3-3為Penicillium paneum，菌株3-4為Candida tartarivorans，菌株4-2為Lactobacillus plantarum，菌株5-1為Issatchenkia orientalis。該菌株已被山東農業微生物菌種資源保藏與利用中心（AMCC）收錄。

3 結 論

本實驗表明，自然發酵蘋果渣中的主體微生物為酵母菌和乳酸菌，其次為霉菌，未分離到放線菌；除自然發酵蘋果渣表層中存在少量霉菌，其余與李志西等[6]分析的結果基本一致。自然發酵蘋果渣不同層次優勢菌群不同，從第一層篩選出3 株菌，其優勢菌群為黑曲霉（AMCC 300003）；第二層篩選出4 株菌，其優勢菌群為乳酸鏈球菌（AMCC 100047）；第三層篩選出2 株菌，其優勢菌群為馬克斯克魯維酵母（AMCC 200010）；第四層篩選出1 株菌，優勢菌群為東方伊薩酵母（AMCC 200014）。

對分離所得的10 株菌株通過形態學觀察、生理生化測定和分子生物學等多相分類法進行了鑒定，初步鑒定結果如下：5 株為酵母屬，2 株為乳酸菌屬，2 株為曲霉屬，1 株為青霉屬。這些菌株可能來源于果汁加工過程中果渣本身存在的，或是果渣運輸過程中運輸工具上的，也可能來自果渣貯藏環境的，這些菌株在生產中的應用價值還需進一步深入研究。

自然發酵狀態下蘋果渣的這種層次和菌群結構的形成可能由以下因素決定：氧分壓、溫度和pH值（3.0～3.5）。這種特殊的果渣菌群結構是特定環境條件和營養條件共同決定的。

本實驗分離菌株中，酵母屬和乳酸菌屬為優勢菌，以此為基礎開發微生態產品，對動物的健康養殖具有良好的積極促進作用；蘋果渣淺層中存在少量的曲霉屬和青霉屬菌株，作為動物飼用是否存在安全隱患，還需進一步深入研究；建議表層約10%的蘋果渣去除之后再使用，以確保自然發酵果渣飼用的安全性。

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Analysis of Micr oflora Profile in Naturally Fermented Apple Pomace

SUN Wen-jing1, CHEN Yi-lun1, WU Mao-yu2, WANG Feng-zhong3, HUANG Kun-yong4, ZHU Yu-zhu1, ZHOU Bo1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China; 2. Jinan Fruit Research Institute, All China Federation of Supply and Marketing Cooper atives, Jinan 250014, China; 3. Institute of Agro-products Processing Sciences and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 4. Biotechnology Corporation of Zhongning Mu-guang, Zhongwei 755100, China)

In order to investigate the microflora in different temperature layers of naturally fermented apple pomace, the microorganisms were obtained by selective plate method and identified by morphology observation, physiological and biochemical characteristics and molecular biological techniques (ITS region, 26S rRNA and 16S rRNA gene sequence analysis). The results indicated that the major microorganisms of spontaneously fermented apple pomace included yeast and Lactobacillus, and ten strains were isolated from four temperature layers. The dominant bacteria from four temperature layers were identified as Aspergillus niger, Lactococcus lactis, Kluyveromyces marxianus and Issatchenkia orientalis, respectively.

natural fermentation; apple pomace; microflora; polyphasic taxonomy

Q939.9

A

1002-6630（2014）23-0193-06

10.7506/spkx1002-6630-201423038

2013-12-02

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD11B01；2012BAD31B01）

孫文靜（1988—），女，碩士，研究方向為農產品加工及貯藏和微生物發酵。E-mail：sunwenjing9178@126.com

*通信作者：周波（1972—），男，副教授，博士，研究方向為微生物資源。E-mail：zhoubo2798@163.com