雙歧桿菌RH胞外多糖提取純化及體外抗凝血活性評(píng)價(jià)

李 輝，宋居易，劉 蕾，李平蘭

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

雙歧桿菌RH胞外多糖提取純化及體外抗凝血活性評(píng)價(jià)

李 輝，宋居易，劉 蕾，李平蘭*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

為得到高純度雙歧桿菌RH胞外多糖，并探討其抗凝血功效，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解提取工藝。優(yōu)化最佳酶解條件為：蛋白酶添加量2 g/L，中性蛋白酶與胰蛋白酶質(zhì)量比例為1∶2，在pH 7.5的條件下酶解120 min。再經(jīng)凝膠Sepharose CL-6B柱層析純化，得到胞外多糖純品。利用凝膠色譜結(jié)合多角度激光散射儀測(cè)得該胞外多糖分子質(zhì)量為5.946×104D。進(jìn)一步對(duì)其抗 凝血活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，不同質(zhì)量濃度胞外多糖可以顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間和凝血酶時(shí)間，且具有劑量依賴效應(yīng)。純化后胞外多糖純度可以達(dá)到97%以上，純多糖具有較好的體外抗凝血活性，主要參與內(nèi)源凝血途徑。

雙歧桿菌；胞外多糖；提取；純化；抗凝血

微生物能夠產(chǎn)生多種類型的多糖，根據(jù)其與細(xì)胞壁的相對(duì)位置可以分為：莢膜多糖和胞外多糖[1-2]。胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是細(xì)菌在生長(zhǎng)過程中分泌到細(xì)胞外的長(zhǎng)鏈多糖，可以松散地附著在菌體表面或者完全釋放到環(huán)境中[3]。EPS屬于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并不作為產(chǎn)生菌的能源物質(zhì)。EPS具有生物防御功能，例如：抗干燥、抵抗原生動(dòng)物的吞噬及噬菌體的浸染、拮抗?jié)B透脅迫等；此外，EPS還具有細(xì)胞識(shí)別、表面黏附、形成生物被膜促進(jìn)菌體定植的功能[4-5]。乳酸菌EPS在水溶液里具有增稠和凝膠的特性，能夠改善發(fā)酵乳的質(zhì)地，且乳酸菌具有公認(rèn)的安全性，其產(chǎn)生的EPS可以替代工業(yè)增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑廣泛用于食品配方中[6]。20世紀(jì)40年代開發(fā)出的由腸膜明串珠菌產(chǎn)生的右旋糖酐是最早被開發(fā)利用的乳酸菌EPS，也是FDA批準(zhǔn)的第一種可用于食品的微生物EPS[7]。眾多研究表明藻類多糖和真菌多糖具有抗凝血功能，對(duì)凝血酶原、凝血酶、白陶土部分凝血活酶進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)多糖在凝血過程中能顯著延長(zhǎng)這些酶和酶原凝血時(shí)間，且與劑量呈正相關(guān)[8-11]。乳酸菌EPS是否同樣具有抗凝血活性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

雙歧桿菌RH菌株源自世界長(zhǎng)壽之鄉(xiāng)——廣西巴馬瑤族自治縣長(zhǎng)壽老人腸道，由實(shí)驗(yàn)室分離并保存。菌株經(jīng)生理化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析，鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。該菌株能夠產(chǎn)生水溶性EPS，其基因組信息（GenBank登錄號(hào)：CP007755.1）也表明該菌株具有EPS生物合成特性[12]。前期研究表明該胞外多糖具有修復(fù)腸黏膜損傷、引起腸黏膜免疫調(diào)節(jié)、平衡腸道菌相等功能[13]，還具有體內(nèi)體外的抗氧化活性[14]。因此，對(duì)EPS生物活性的研究具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用酶解法和凝膠柱層析對(duì)雙歧桿菌RH EPS進(jìn)行提取純化，得到純度較高的EPS，探究EPS體外抗凝血活性。研究結(jié)論豐富了現(xiàn)有雙歧桿菌EPS功能，并為新型保健品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

動(dòng)物雙歧桿菌（Bif dobacterium animalis RH）：由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

兔血：采自新西蘭大耳白兔，SPF級(jí)成年雄性4 kg。

脫脂乳培養(yǎng)基：脫脂乳粉120 g，蒸餾水1 L，充氮?dú)猓?05 ℃滅菌10 min。

1.2 試劑

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 美國Sigma公司；胰蛋白酶 美國Amresco公司；中性蛋白酶 北京Solarbio公司；風(fēng)味蛋白酶 江蘇銳陽生物技術(shù)公司；凝血酶原時(shí)間（prothrombintime，PT）測(cè)定試劑盒、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）測(cè)定試劑盒、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）測(cè)定試劑盒 美國太平洋公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

DHL-A電腦恒流泵、BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；FD-1D冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Tskgel G4000 PWXL凝膠色譜柱 日本Tosoh公司；DAWN HELEOSⅡ多角度激光散射儀、Optilab rex示差檢測(cè)器 美國懷雅特技術(shù)公司；ACL TOP700自動(dòng)血凝儀 美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)糖發(fā)酵

菌種在脫脂乳培養(yǎng)基中活化3 代，取對(duì)數(shù)末期培養(yǎng)液接種至新鮮無菌脫脂乳培養(yǎng)基，接種量為107CFU/mL，于37 ℃厭氧發(fā)酵60 h。

1.4.2 酶解法除蛋白條件優(yōu)化

按照1.4.1節(jié)所述發(fā)酵液用4 層醫(yī)用紗布過濾，去除酸沉酪蛋白塊。過濾液100 ℃加熱5 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.1 不同蛋白酶酶解效率

根據(jù)每種蛋白酶最佳反應(yīng)條件（表1）調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值（胃蛋白酶處理組選用發(fā)酵上清液pH值），添加2 mg/mL蛋白酶，最佳反應(yīng)溫度下酶解90 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液；上清液用8 000～12 000 D透析袋，4 ℃透析48 h；添加3 倍體積無水乙醇，4 ℃沉淀過夜；沉淀用原體積蒸餾水復(fù)溶，檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白去除率。對(duì)照組除不添加蛋白酶外，其他操作與實(shí)驗(yàn)組相同。三氯乙酸處理組，向發(fā)酵上清液中添加4%三氯乙酸，4 ℃沉淀2 h，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復(fù)溶步驟同上。

式中：A0為對(duì)照組蛋白質(zhì)含量/（mg/mL）；An為實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)含量/（mg/mL）。

表1 不同蛋白酶性質(zhì)及酶活力Table1 Protease characteristics and enzyme activities

1.4.2.2 蛋白酶添加量對(duì)酶解效率的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值為7.5，分別添加1、2、4、6、8、10 mg/mL復(fù)合蛋白酶，中性蛋白酶與胰蛋白酶復(fù)合質(zhì)量比（簡(jiǎn)寫為m（中）∶m（胰），下同）為1∶1，45 ℃酶解90 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復(fù)溶步驟同上，檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白去除率。

1.4.2.3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效率的影響

調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值為7.5，添加3 mg/mL中性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶，m（中）∶m（胰）=1∶1，45 ℃酶解60、90、120、150、180 min，沸水浴滅酶5 min，8 000 r/min離心10 min保留上清液，透析、醇沉、復(fù)溶步驟同上，檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白去除率。

1.4.2.4 酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將中性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合使用。選取酶的添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶的復(fù)合比例4 個(gè)因素，各取3 個(gè)水平，以蛋白去除率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

1.4.3 EPS分離提取

選取正交試驗(yàn)最優(yōu)條件進(jìn)行酶解，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶5 min，冷卻后8 000 r/min離心10 min；上清液中加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃沉淀過夜，沉淀用少量蒸餾水復(fù)溶，8 000～12 000 D透析袋4 ℃透析48 h，真空冷凍干燥后獲得EPS粗品，避光干燥保存。

1.4.4 EPS純化

EPS用蒸餾水配制成5 mg/mL糖液，0.45 μm水系濾膜過濾后進(jìn)行Sepharose CL-6B凝膠柱層析，上樣量為4 mL用0.05 mol/L NaCl恒速洗脫，洗脫速率為0.8 mL/min，每管8 mL部分收集，逐管檢測(cè)多糖含量（苯酚-硫酸法[15]測(cè)定A490nm），按多糖含量檢測(cè)值收集峰值管，8 000～12 000 D透析袋透析并冷凍干燥。

1.4.5 EPS鑒定

利用凝膠色譜結(jié)合多角度激光散射儀檢測(cè)EPS純度和分子質(zhì)量。將EPS純品用0.1 mol/L NaNO3配制成2 mg/mL的溶液，進(jìn)樣量200 μL。色譜條件：凝膠柱色譜柱Tskgel G4000 PWXL（78 mm×300 mm），DAWN HELEOSⅡ型多角度激光散射儀，Optilab rex型示差檢測(cè)器；柱溫25 ℃，流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3溶液，流速0.5 mL/min。

1.4.6 EPS體外抗凝血活性評(píng)價(jià)

兔耳緣靜脈取血，按9∶1比例收集于含3.8 g/100 mL的枸櫞酸鈉抗凝劑管中。輕輕混勻，3 000 r/min離心15 min，取血清用于凝血活性實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)PT、APTT、TT，向360 μL血清中添加高、中、低不同質(zhì)量濃度EPS樣品各40 μL，使EPS終質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0 mg/mL，37 ℃孵育10 min，自動(dòng)凝血儀檢測(cè)凝血時(shí)間，以血清樣品作對(duì)照[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解法除蛋白單條件優(yōu)化

2.1.1 不同蛋白酶酶解效率

不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)不同，針對(duì)不同底物，不同蛋白酶的酶解效率也存在差異。實(shí)驗(yàn)選取6 種蛋白酶對(duì)雙歧桿菌發(fā)酵上清液進(jìn)行酶解，不同蛋白酶的蛋白去除率見圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解效率Fig.1 Hydrolysis efficiency of different proteases

三氯乙酸處理組蛋白質(zhì)去除率最高。在不同的蛋白酶處理組中，堿性蛋白酶的酶解效率最高，但需要較高的pH值條件才能發(fā)揮活性。中性蛋白酶對(duì)酪蛋白的水解能力很強(qiáng)，胰蛋白酶對(duì)乳清蛋白的水解能力較強(qiáng)；脫脂乳培養(yǎng)基中酪蛋白和乳清蛋白的含量較高，文獻(xiàn)[18]報(bào)道將中性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合使用能夠提高乳蛋白的水解效率；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)合酶解效率大于兩種酶單一使用的效率。胃蛋白酶的酶活力很高，但是酶解效率較低，可能與酶解的pH值條件有關(guān)；產(chǎn)糖發(fā)酵上清液的pH值為4.53，為保證多糖穩(wěn)定性未將發(fā)酵上清液的pH值調(diào)至胃蛋白酶的最佳pH值，從而影響胃蛋白酶的活性。綜合酶解效率、反應(yīng)最適溫度和pH值條件，選取中性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 酶添加量的影響

蛋白酶的添加量是影響酶解效率的重要因素。酶添加量不足，酶被底物飽和，酶解效率低；酶過量，則向溶液引入過多外源蛋白。將中性蛋白酶和胰蛋白酶按照1∶1的復(fù)合質(zhì)量比例進(jìn)行添加，不同酶添加量對(duì)酶解效率的影響見圖2。

圖2 不同蛋白酶添加量酶解效率Fig.2 Hydrolysis efficiency of different proteases at various addition amounts

由圖2可知，添加1 mg/mL蛋白酶，酶量不足，酶解效率偏低；添加2 mg/mL蛋白酶，酶解效率最高；添加量超過4 mg/mL，外源蛋白引入量加大，殘留蛋白含量增加。所以，蛋白酶添加量在2～4 mg/mL最佳。

2.1.3 酶解時(shí)間的影響

圖3 不同酶解時(shí)間酶解效率Fig.3 Hydrolysis efficiency of mixture of neutral protease and trypsin as a function of hydrolysis duration

按m（中）∶m（胰）=1∶1的比例添加3 mg/mL蛋白酶，分別酶解60、90、120、150、180 min，定期取樣滅活，透析后測(cè)定蛋白去除率。由圖3可知，延長(zhǎng)酶解時(shí)間能夠提高蛋白去除率，但長(zhǎng)時(shí)間的處理可能會(huì)影響多糖保留率及活性，應(yīng)兼顧節(jié)能高效選取最佳作用時(shí)間。

2.1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白酶最佳添加量在2～4 mg/mL，延長(zhǎng)酶解時(shí)間可以提高蛋白去除率。中性蛋白酶最佳pH值為7.0，胰蛋白酶最佳pH值為8.0。選擇酶的添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶的復(fù)合比例，各取三水平，以蛋白去除率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表2 酶解條件正交試驗(yàn)優(yōu)化方案及結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of enzymatic hydrolysis conditions

根據(jù)表2直觀分析可知，各因素對(duì)蛋白質(zhì)去除效果的影響由大到小依次為：酶的添加量＞m（中）∶m（胰）＞酶解時(shí)間＞pH值。根據(jù)各因素各水平均值確定酶解條件的最優(yōu)組合是A1B2C2D3，即按照m（中）∶m（胰）= 1∶2，添加量2 mg/mL，在pH 7.5的條件下酶解120 min。方差分析結(jié)果表明，因素A和D的P值＜0.05，即因素A和D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。因此因素A和D為主要因素，B和C為次要因素，直觀分析結(jié)果可信。

因中性蛋白酶酶解最適溫度在40 ℃左右，胰蛋白酶酶解最適溫度為45 ℃，在單因素試驗(yàn)中，酶解溫度40～50 ℃的范圍對(duì)酶解效果的影響很小，結(jié)合兩種酶的特性，確定酶解溫度為45 ℃。

2.2 凝膠柱層析純化

凝膠柱層析具有分子篩的作用，可根據(jù)分子質(zhì)量不同或聚合度不同將混合物分離開。利用Sepharose CL-6B凝膠柱對(duì)EPS進(jìn)行分離純化。EPS在Sepharose CL-6B凝膠柱上洗脫曲線如圖4所示，洗脫曲線呈現(xiàn)單一的對(duì)稱峰，峰型完整無拖尾現(xiàn)象，說明其為分子質(zhì)量均一的單一組分。收集峰值管的洗脫液，透析后冷凍干燥即為EPS純品，用于后續(xù)純度和分子質(zhì)量測(cè)定。

圖4 EPS Sepharose CL-6B凝膠柱層析洗脫曲線Fig.4 Gel permeation chromatography of EPS on Sepharose CL-6B column

2.3 EPS純度和分子質(zhì)量

多糖的分子質(zhì)量只代表鏈長(zhǎng)的平均分布，利用不同方法測(cè)得多糖分子質(zhì)量的結(jié)果也有較大差別。實(shí)驗(yàn)利用凝膠色譜結(jié)合多角度激光散射儀（gel permeation chromatography multiangle laser light scattering，GPC/ MALLS）檢測(cè)多糖分子質(zhì)量及分布。雙歧桿菌EPS凝膠色譜如圖5所示，第1個(gè)峰是大分子顆粒峰，但該峰只有激光值，沒有示差值，代表該物質(zhì)濃度很低。第2個(gè)峰是多糖峰，且三氯乙酸純化的EPS經(jīng)GPC/MALLS檢測(cè)峰型與此相同，激光值與示差值相繼出峰，示差峰與紫外峰同步，推測(cè)該EPS為糖蛋白。后續(xù)的小峰是雜質(zhì)峰。

圖5 EPS GPC/MALLS凝膠色譜Fig.5 GPC/MALLS of EPS

表3 EPS純度及分子質(zhì)量Table3 Molecular weight and purity of EPS

由表3可知，利用凝膠色譜結(jié)合多角度激光散射儀測(cè)得雙歧桿菌RH所產(chǎn)EPS的分子質(zhì)量為5.946×104D，根據(jù)積峰值計(jì)算純度為97.045%。三氯乙酸純化EPS分子質(zhì)量為5.607×104D，兩種去蛋白方法對(duì)EPS分子質(zhì)量的影響較小，蛋白酶并未降解糖苷鍵。

Mw/Mn的值為多糖多分散系數(shù)（d），其大小是判斷樣品摩爾質(zhì)量分布是否均勻的指標(biāo)。樣品分子大小均一時(shí)，d值應(yīng)比較小或接近1.0，表3顯示EPS的多分散系數(shù)為1.231，進(jìn)一步說明雙歧桿菌EPS是寬分散的。

2.4 EPS體外抗凝血活性評(píng)價(jià)結(jié)果

凝血的過程包括：凝血酶原激活物的形成，凝血酶的形成，進(jìn)一步促進(jìn)纖維蛋白的形成[19]。根據(jù)凝血酶原激活物形成的途徑和參與因子，可將凝血分為內(nèi)源性凝血和外源性凝血兩條途徑。內(nèi)源性凝血，參與凝血的全部因子來源于血漿；外源性凝血，啟動(dòng)源于組織因子。PT、APTT、TT作為評(píng)價(jià)血液凝固能力的指標(biāo)，其中PT反映外源凝血系統(tǒng)狀況，APTT反映內(nèi)源凝血系統(tǒng)狀況。

表4 不同質(zhì)量濃度EPS體外抗凝血活性Table4 Anticoagulant activity of EPS with different concentrations

由表4可知，不同質(zhì)量濃度EPS可以顯著延長(zhǎng)APTT和TT，且具有劑量依賴效應(yīng)，但對(duì)PT沒有延長(zhǎng)作用。說明EPS具有一定的抗凝血活性，主要參與內(nèi)源凝血途徑，并且進(jìn)一步抑制凝血酶介導(dǎo)的纖維蛋白的形成來發(fā)揮抗凝血功效。

3 結(jié) 論

多糖提純的第一步是除蛋白，已報(bào)道的多糖除蛋白方法多為化學(xué)試劑法[20-21]。該方法不僅大量消耗有機(jī)試劑，多次、長(zhǎng)時(shí)間處理可能會(huì)影響多糖的生物活性，并且殘留的化學(xué)試劑存在安全隱患，也不符合食品和保健品生產(chǎn)規(guī)范。本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)妹附夥ń到獾鞍祝怪附鉃榉肿淤|(zhì)量較小的多肽或氨基酸，最后通過乙醇沉淀和透析除去保留在溶液中的多肽和氨基酸，由此達(dá)到去除蛋白的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合酶解法對(duì)乳蛋白的水解效果較好，可以替代有機(jī)試劑法作為EPS的純化方法。

肝素是臨床上廣泛應(yīng)用的抗凝劑，但肝素多來源于動(dòng)物組織和臟器，可能攜帶致敏原或致病微生物對(duì)患者造成危害[22]。此外，肝素還容易造成自發(fā)性出血和血小板減少癥，尋找更加安全有效的肝素替代物成為研究熱點(diǎn)。血漿中添加抗凝劑，若PT、TT大于正常范圍3 s，APTT大于正常范圍10 s，被認(rèn)為可以延長(zhǎng)凝血時(shí)間具有抗凝效果[23]。實(shí)驗(yàn)證明雙歧桿菌RH EPS可顯著延長(zhǎng)APTT和TT，具有一定的體外抗凝血活性，主要參與內(nèi)源凝血途徑，這與肝素的作用機(jī)理相似。前期研究表明，該EPS含有糖醛酸[13]，D-葡萄糖醛酸又是構(gòu)成肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的成分，所以EPS具有抗凝血活性可能與其含有糖醛酸有關(guān)。雙歧桿菌RH EPS具有一定的體外抗凝血活性為進(jìn)一步研究乳酸菌EPS的藥用價(jià)值提供了依據(jù)，但其具體的抗凝血機(jī)制有待進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

[1] SUTHERLAND I W. Novel and established applications of microbial polysaccharides[J]. Trends in Biotechnology, 1998, 16(1): 41-46.

[2] de VUYST L D, de VIN F, VANINGELGEM F, et al. Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(9): 687-707.

[3] RUAS-MADIEDO P, HUGENHOLTZ P, ZOON P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acidbacteria[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(2/3): 163-171.

[4] LOOIJESTEIJN P J, TRAPET L, VRIES E, et al. Physiological function of exopolysaccharides produced by Lactococc us lactis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 64(1/2): 71-80.

[5] WHITFIELD C, VALVANO M A. Biosynthesis and expression of cell surface polysaccharides in gram-negative bacteria[J]. Advances in Microbiology and Physiology, 1993, 35: 135-146.

[6] ISMAIL B, NAMPOOTHIRI K M. Production, purification and structural characterization of an exopolysaccharide produced by a probiotic Lactobacillus plantarum MTCC 9510[J]. Archives of Microbiology, 2010, 192(12): 1049-1057.

[7] STAAT R H, GAWRONSKI T H, SCHACHTELE C F. Detection and preliminary studies on dextranase-producing microorganisms from human dental plaque[J]. Infection and Immunity, 1973, 8(6): 1009-1016.

[8] MATSUBARA K, MATSUURA Y, BACIC A, et al. Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga Codium cylindricum[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 28(5): 395-399.

[9] MAJDOUB H, ROUDESLI M S, MANSOUR M B. Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from the green alga Arthrospira platensis[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2009, 1790(10): 1377-1381.

[10] 汪艷秋, 劉憲麗, 劉東穎, 等. 刺松藻多糖抗凝血及抗血栓作用的研究[J]. 安徽醫(yī)藥, 2011, 15(7): 804-806.

[11] MOURAO P A, YOON S J, YU M A, et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin[J]. Thrombosis Research, 2003, 112(3): 151-158.

[12] 劉麗莎, 范熠, 旭日花, 等. 動(dòng)物雙歧桿菌RH胞外多糖基因簇的克隆及分析[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(15): 136-142.

[13] 旭日花. 雙歧桿菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)解析及調(diào)節(jié)腸黏膜免疫功能研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011.

[14] XU Rihua, SHANG Nan, LI Pinglan. in vitro and in vivo antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Bif dobacterium animalis RH[J]. Anaerobe, 2011, 17(5): 226-231.

[15] DUBOIS M, GILLES K, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugar and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-365.

[16] CAI Weirong, XIE Liangliang, CHEN Yong, et al. Purification, characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 92(2): 1086-1090.

[17] 楊曦明, 范聰, 李慧萍, 等. 白樹花多糖硫酸酯的抗凝血活性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué), 2010, 14(7): 1031-1034.

[18] 齊世宇. 酶水解法降低乳蛋白致敏性的研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[19] MACFARLANE R G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier[J]. Nature, 1964, 202: 498-499.

[20] PAULO E, BOFFO E F, BRANCO A, et al. Production, extraction and characterization of exopolysaccharides produced by the native Leuconostoc pseudomesenteroides R2 strain[J]. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 2012, 84(2): 495-507.

[21] DABOUR N, LAPOINTE G. Identification and molecular characterization of the chromosomal exopolysaccharide biosynthesis gene cluster from Lactococcus lactis subsp. cremoris SMQ-461[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71: 7414-7425.

[22] CHARLES H B. Heparin and thrombosis[J]. British Medical Journal, 1938, 2: 977-981.

[23] 朱立華. 實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)[M]. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)出版社, 2002: 144-146.

Extraction, Purification and in vitro Anticoagulant Activity of Exopolysaccharides from Bif dobacterium animalis RH

LI Hui, SONG Ju-yi, LIU Lei, LI Ping-lan*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Exopolysaccharides (EPS) are water-soluble extracellular polysaccharides with potential biological activities. In this study, we investigated the extraction, purification and anticoagulant activity of the EPS produced by Bif dobacteria animalis RH. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were found to be 120 min hydrolysis using a mixture of neutral protease with trypsin (1:2) at a total concentration of 2 g/L with an initial pH of 7.5 by orthogonal array design. The EPS was purified by Sepharose CL-6B column chromatography. The purity was 97.045% and the average molecular mass of the EPS was 5.946 × 104D as determined by GPC/MALLS. Furthermore, anticoagulant activity in vitro tests showed the EPS could significantly prolong activated partial thromboplastin time (APTT) and thrombin time (TT) in a dosedependent manner, rather than prothrombin time (PT). These results demonstrated that the EPS exhibited a significant anticoagulant activity in vitro.

Bif dobacterium; exopolysaccharides; extraction; purification; anticoagulation

Q939.99

A

1002-6630（2014）23-0129-05

10.7506/spkx1002-6630-201423026

2014-09-09

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271827）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（5122018）

李輝（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橐嫔钚源x產(chǎn)物。E-mail：feifeilihui@126.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：lipinglan@cau.edu.cn