一株野油菜黃單胞菌產黃原膠的性質

張建國，黃勛娟

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

一株野油菜黃單胞菌產黃原膠的性質

張建國，黃勛娟

（上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

通過發酵一株野油菜黃單胞菌得到黃原膠，進而測定該黃原膠在不同質量濃度、pH值、氯化鈉質量濃度、溫度下黏度變化，分析黃原膠流變特性、丙酮酸質量分數和黏均分子質量。結果表明：本實驗菌株的黃原膠產量達到28.4 g/L，黃原膠黏度在質量濃度高于4.0 g/L時迅速升高，黃原膠黏度在pH 3.0～10.0之間穩定。氯化鈉質量濃度由10 g/L增加到70 g/L時，使1.0 g/L黃原膠黏度提高20%，而溫度高于35 ℃時使1.0 g/L黃原膠黏度降低。黃原膠的丙酮酸質量分數達到6.35%，黏均分子質量為5.7×106D。1.0 g/L黃原膠的稠度系數和流體指數分別為26.94和0.765 5，5.0 g/L黃原膠的稠度系數和流體指數分別為489.65和0.328 1。研究表明該株野油菜黃單胞菌具有較大的潛在應用價值。

野油菜黃單胞菌；黃原膠；黏度；假塑性流體；丙酮酸質量分數

黃原膠，又名漢生膠，具有優良的水溶性、增稠性和流變性。早在1969年被美國食品藥品管理局（U.S. Food and Drug Administration，FDA）批準為食品中不限量添加劑。至今，黃原膠已經被廣泛用于食品[1]、化妝品、化工[2]、農藥[3]等行業中。尤其在食品行業中對淀粉糊化[4]、干酪的質構[5]、肉制品的品質[6]等諸多方面有顯著的效果。黃原膠的結構由5 個糖分子（兩個葡萄糖、兩個甘露糖、一個葡萄糖醛酸）和乙酸、丙酮酸組成的重復單元。其中，兩個葡萄糖分子以β-1,4-糖苷鍵相連作為主鏈，剩下的3 個糖分子作為支鏈。支鏈中葡萄糖醛酸處于中間位置，兩端是甘露糖分子。靠近主鏈的甘露糖會被乙酰基修飾，末端的甘露糖和丙酮酸發生縮醛反應。黃原膠分子質量在2×106～2×107D之間。乙酸、丙酮酸質量分數和三糖支鏈質量分數的不同會導致黃原膠性質的差異[7]。另外，黃原膠在溶液中的構象不同也影響黃原膠性質。不同的黃原膠產生菌所產生的黃原膠組分和性質也不同[8]。黃原膠的主要生產菌是野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris），另外被報道的產生菌還有草莓角斑病菌（Xanthomonas fragaria）、甘藍黑腐黃單胞菌變種（Xanthomonas gummisudans）等。培養條件不同也是導致黃原膠的組分和性質出現差異的重要因素，例如培養基的碳源、氮源、pH值、溫度都影響黃原膠的生產效率和性質[9]。本研究分析了一株野油菜黃單胞菌所產黃原膠的性質，表明該菌可以產生性質優良的黃原膠，具有較大潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

野油菜黃單胞菌為上海理工大學醫療器械與食品學院實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、2,4-二硝基苯肼等均為分析純 國藥集團（上海）化學試劑有限公司。

NDJ-5S旋轉式黏度計 上海昌吉地質儀器有限公司；UV752紫外分光光度計 上海光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養野油菜黃單胞菌生產黃原膠

野油菜黃單胞菌首先接種到種子培養基（葡萄糖20.0 g/L、牛肉膏0.5 g/L、蛋白胨 3.0 g/L、酵母粉1.0 g/L），然后在28 ℃、180 r/min的搖床上培養24 h。將種子培養基以5%接種量轉接到100 mL發酵培養基（葡萄糖45.0 g/L、蛋白胨3.0 g/L、碳酸鈣3.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂2.5 g/L、硫酸亞鐵0.25 g/L、檸檬酸0.25 g/L，pH 7.0），在28 ℃、180 r/min培養120 h。

在50 mL發酵液中加入100 mL的95%乙醇，室溫下攪拌30 min，過濾分離乙醇，再加入發酵液50 mL乙醇攪拌過濾。將得到的黃原膠置于烘箱中60 ℃烘至恒質量，最后稱黃原膠的質量。

1.3.2 黃原膠的黏度分析

稱取一定量的黃原膠，在25 ℃時溶解于去離子水中。利用鹽酸和氫氧化鈉調節pH值。鹽質量濃度用氯化鈉質量濃度表示。測量黏度時利用水浴鍋控制溫 度。利用旋轉式黏度計選擇合適的轉子，將轉子浸入黃原膠溶液中，黏度所占的百分比在10%～100%之間。

1.3.3 假塑性流體參數的計算

利用黏度計測定不同轉速時的黏度，根據公式（2）得到K和n。

式中：τ為剪切力/mPa；γ為剪切速率/min－1；K為稠度系數；n為流體指數。

1.3.4 丙酮酸質量分數的測定

以1 mol/L鹽酸為溶劑，配制20.0 g/L的黃原膠溶液。在100 ℃條件下水解3 h。然后取50 μL水解液，加入0.25 mL 2.0 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液，搖勻。再加入5 mL 1.5 mol/L氫氧化鈉溶液，生成紫紅色2,4-二硝基苯腙衍生物顯色，在520 nm波長處比色，計算黃原膠中丙酮酸質量分數[10]。

1.3.5 黏均分子質量計算

高聚物在稀溶液中的黏度是高聚物在流動過程內摩擦的反映，可以按照公式（4）、（5）、（6）推導出公式（7）、（8）。

利用公式（7）、（8）擬合黃原膠質量濃度接近0時的特性黏度[η]，再利用公式（9）計算出黏均分子質量。

式中：η為表觀黏度/（mPa·s）；η0為純溶劑的黏度/（mPa·s）；ηsp為增比黏度/（mPa·s）；ηr為相對黏度/（mPa·s）；[η]為特性黏度/（mPa·s），反映無限稀溶液中高聚物分子與溶劑分子之間的內摩擦；ρ為黃原膠質量濃度/（g/L）；M為黃原膠分子質量的平均值/D；K為比例常數；α為與黃原膠在溶液中的形態有關的經驗參數Mark-Houwink參數查閱文獻[11-12]取：α=1.140、K=0.000 17 mL/mg。

1.4 數據分析

所有分析實驗都是重復3 次實驗取平均值。利用SPSS 13.0對黃原膠黏度在不同pH值時的波動，以及在不同溫度時黃原膠黏度進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 野油菜黃單胞菌生產黃原膠

圖1 野油菜黃單胞菌糖消耗和產黃原膠的變化曲線Fig.1 Time courses of glucose concentration and xanthan production by Xanthomonas campestris

由圖1可知，在120 h的培養過程中葡萄糖質量濃度逐漸減少，尤其在48 h內迅速減少。而黃原膠產量在初始72 h內快速升高到27.0 g/L，72 h后產量緩慢增加，120 h時的產量達到28.4 g/L，高于一些報道的黃原膠產量[13]，也達到了其他研究在發酵罐上培養野油菜黃單胞菌生產黃原膠的水平[14]。

2.2 不同質量濃度黃原膠的黏度變化

圖2 不同質量濃度黃原膠的黏度變化Fig.2 Viscosities of xanthan at different concentrations

由圖2可知，黃原膠的黏度均隨著質量濃度的升高而升高。黃原膠的質量濃度在4.0 g/L以下黏度緩慢升高，質量濃度高于4.0 g/L后黏度快速升高。黃原膠質量濃度為9.0 g/L時的黏度為2 656.67 mPa·s。該黃原膠高黏度可以減少黃原膠的使用量。

2.3 不同pH值對黃原膠黏度的影響

圖3 pH值對黃原膠黏度的影響Fig.3 Effect of pH on the viscosity of xanthan

利用鹽酸和氫氧化鈉分別調節1.0 g/L黃原膠的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。由圖3可知，質量濃度為1.0 g/L的黃原膠黏度在pH 3.0～10.0之間波動不明顯，黏度維持在28.0 mPa·s，黃原膠黏度的標準偏差為0.617 mPa·s。這說明該種黃原膠可以在較為廣闊的pH值范圍內發揮作用。

2.4 氯化鈉質量濃度對黃原膠黏度的影響

以氯化鈉分別調節1.0 g/L黃原膠的鹽質量濃度為10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0 g/L。由圖4可知，1.0 g/L黃原膠的黏度隨著氯化鈉質量濃度升高而升高，這和Whistler[15]報道的黃原膠黏度受鹽質量濃度影響的結果一致，因為鹽離子明顯增加低質量濃度黃原膠分子間電荷相互作用[16]。在氯化鈉質量濃度由10 g/L增加到70 g/L時，黃原膠黏度由30.0 mPa·s升高到36.0 mPa·s，上升了20.0%。

圖4 氯化鈉質量濃度對黃原膠黏度的影響Fig.4 Effect of NaCl concentration on the viscosity of xanthan

2.5 溫度對黃原膠黏度的影響

圖5 溫度對黃原膠黏度的影響Fig.5 Viscosities of xanthan at different temperatures

在溫度為15.0、25.0、35.0、45.0、55.0、65.0 ℃時測量1.0 g/L黃原膠的黏度，由圖5可知，隨著溫度由15.0 ℃上升到65.0 ℃，黃原膠黏度先由32 mPa·s上升到34 mPa·s，后下降到20 mPa·s。在溫度為35 ℃時黃原膠的黏度與溫度為15、25 ℃時黃原膠黏度有顯著差異。黃原膠黏度在溫度高于35 ℃時逐漸下降，但是下降幅度（41.18%）比Desplanques等[17]報道的下降幅度小，這是因為所使用的黃原膠性質不同。較低溫度時，黃原膠分子呈現螺旋狀結構，三糖支鏈以反向方式纏繞主鏈骨架，通過氫鍵維持棒狀雙螺旋結構，雙螺旋的黃原膠之間以非共價鍵結合形成復合體，表現出高黏度[18]。溫度升高時黃原膠分子由雙螺旋結構變為無規則線團結構，使黏度迅速下降。

2.6 黃原膠的丙酮酸質量分數和黏均分子質量

經測定得，黃原膠丙酮酸質量分數為6.35%。黏均分子質量為5.7×106D。丙酮酸質量分數對黃原膠的黏度有明顯影響，質量濃度為10.0 g/L的高丙酮酸黃原膠（丙酮酸質量分數為5.29%）比普通黃原膠（丙酮酸質量分數為4.74%）的黏度高16.5%[19-20]。在丙酮酸質量分數高于0.31%的黃原膠添加鉀離子增加黃原膠的黏度[21]。本實驗中黃原膠的丙酮酸質量分數為6.35%，是目前文獻[22]中最接近黃原膠中飽和丙酮酸質量分數（8.69%）的報道，也符合丙酮酸質量分數高的黃原膠黏度高的結果，這與聚合物黏度理論相符合[23]。

2.7 黃原膠的假塑性流體參數計算

圖6 黃原膠的假塑性流體參數Fig.6 Pseudo-plastic fluid parameters of xanthan

質量濃度為1.0 g/L和5.0 g/L的黃原膠的稠度系數和流體指數的計算結果見圖6。黃原膠的稠度系數由1.0 g/L時的26.94上升到5.0 g/L的489.65，流體指數則由0.765 5下降到0.328 1。

3 結 論

本研究報道了一株高產黃原膠的野油菜黃單胞菌在100 mL裝液量的搖瓶中發酵時黃原膠產量達到28.4 g/L。通過分析該黃原膠黏度隨黃原膠質量濃度、pH值、氯化鈉質量濃度、溫度的變化，以及該黃原膠的流變性、丙酮酸質量分數和黏均分子質量，表明本研究采用的菌株具有良好的黃原膠生產潛力。

[1] 任英杰. 黃原膠在食品中的應用[J]. 中國果菜, 2012(4): 45-47.

[2] 任宏洋, 王新惠. 黃原膠的特性, 生產及應用進展[J]. 釀酒, 2010, 37(2): 17-19.

[3] 馮建國, 張小軍, 于遲, 等. 淺談黃原膠及其在農藥制劑加工中的應用[J]. 高分子通報, 2012(11): 91-96.

[4] 唐敏敏, 洪雁, 顧正彪, 等. 黃原膠對綠豆淀粉糊化和流變特性的影響[J]. 食品科學, 2013, 34(21): 42-46.

[5] 肖楊, 苗君蒞, 鄭遠榮, 等. 卡拉膠和黃原膠對酸性凝膠型再制干酪質構的影響[J]. 食品科學, 2012, 33(23): 93-97.

[6] 孫健, 馮美琴, 王鵬, 等. 亞麻籽膠, 黃原膠與大豆分離蛋白對肉制品出品率和質構特性的影響[J]. 食品科學, 2012, 33(21): 1-5.

[7] 程蓉, 張永奎, 張春紅, 等. 高丙酮酸黃原膠的發酵研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(3): 234-236.

[8] GARCIA-OCHOA F, SANTOS V E, CASAS J A, et al. Xanthan gum: production, recovery, and properties[J]. Biotechnology Advances, 2000, 18( 7): 549-579.

[9] PALANIRAJ A, JAYARAMAN V. Production, recovery and applications of xanthan gum by Xanthomonas campestris[J]. Journal of Food Engineering, 2011, 106(1): 1-12.

[10] 秦志剛, 詹曉北, 賈薇, 等. 高丙酮酸黃原膠發酵與流變特 性研究[J].食品與發酵工業, 2007, 33(1): 32-35.

[11] DUMITRIU S. Polysaccharides: structural diversity and functional versatility[M]. 2nd ed. New York: CR C Press, 2012: 466.

[12] HARDING S E, ADAMS G G. An introduction to polysaccharide biotechnology[M]. New York: CRC Press, 1997: 161.

[13] 嚴偉, 李群良, 楊克迪, 等. 響應面法優化黃原膠發酵生產培養基[J].應用化工, 2012, 41(8): 1349-1352.

[14] SAVVIDES A, KATSIFAS E, HATZINIKOLAOU D, et al. Xanthan production by Xanthomonas campestris using whey permeate medium[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(8): 2759-2764.

[15] WHISTLER R L. Industrial gums: polysaccharides and their derivatives[M]. Waltham: Academic Press, 1993: 166.

[16] 黃成棟, 白雪芳, 杜昱光. 黃原膠(Xanthan Gum)的特性, 生產及應用[J].微生物學通報, 2005, 32(2): 91-98.

[17] DESPLANQUES S, GRISEL M, MALHIAC C, et al. Stabilizing effect of acacia gum on the xanthan helical con formation in aqueous solution[J]. Food Hydrocolloids, 2013, 35: 181-188.

[18] 李興存, 張忠智, 王洪君, 等. 黃原膠的性能與應用[J]. 日用化學工業, 2002, 32(5): 47-50.

[19] 趙潤寶, 詹曉北, 鄭志永, 等. 添加游離丙酮酸對黃單胞桿菌產黃原膠中丙酮酸功能基團含量的影響[J]. 食品研究與開發, 20 06, 27(1): 14-17.

[20] CANIDIA J L F, DECKWER W D. Effect of the nitrogen source on pyruvate content and rheological properties of xanthan[J]. Biotechnology Progress, 1999, 15(3): 446-452.

[21] SMITH I, SYMES K, LAWSON C, et al. Influence of the pyruvate content of xanthan on macromolecular association in solution[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 1981, 3(2): 129-134.

[22] WHITFIELD C. Bacterial extracellular polysaccharides[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1988, 34(4): 415-420.

[23] YI G, PINE D J, SACANNA S. Recent progress on patchy colloids and their self-assembly[J]. Journal o f Physics: Condensed Matter, 2013, 25: 193101. doi: 10.1088/0953-8984/25/19/193101.

Properties of Xanthan from Xanthomonas campestris

ZHANG Jian-guo, HUANG Xun-juan
(School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

A strain of Xanthomonas campestris was screened and cultured for the production of xanthan. Effects of xanthan concentration, pH, sodium chloride content and temperature on viscosities were determined. Rheological behaviors, pyruvate content, and molecular weight of xanthan were investigated for further application. The strain produced 28.4 g/L xanthan. The viscosity of xanthan increased rapidly when the concentration was higher than 4.0 g/L, but remained stable in the pH range of 3.0-10.0. The viscosity of 1.0 g/L xanthan was increased by 20% in response to an increase in NaCl concentration from 10 to 70 g/L, but showed a decrease at high temperature (higher than 35 ℃). The xanthan contained 6.35% pyruvate and had a viscosity-average molecular weight of 5.7 × 106D. Coeff cient and f uidity index of the xanthan prepared from Xanthomonas campestris at different concentrations were 26.94 and 0.765 5 for 1.0 g/L, and 489.65 and 0.328 1 for 5.0 g/L, respectively. In conclusion, this strain of Xanthomonas campestris has tremendous application potential.

Xanthomonas campestris; xanthan; viscosity; pseudo-plastic f uid; pyruvate content

TS202

A

1002-6630（2014）23-0029-04

10.7506/spkx1002-6630-201423006

2014-01-12

國家自然科學基金青年科學基金項目（21306112）；上海市自然科學基金項目（13ZR1429100）

張建國（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品與微生物工程。E-mail：jgzhang@usst.edu.cn