吉西他濱對胰腺癌PANC-1細胞中組蛋白去乙酰化酶及TMS1/ASC基因表達的影響

薛曉婕

基因甲基化是抑癌基因失活的主要機制。胰腺癌是一種高度惡性的消化系統腫瘤，發生隱匿，發展迅速，每年的平均發病率與平均死亡率相近，5年存活率不足5%。胰腺癌中許多抑癌基因因CpG島異常超甲基化而失活，甲基化CpG結合蛋白通過與組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)復合體相互作用而實現其抑制作用。甲基化抑制基因轉錄有賴于抑制性染色質環境。HDAC-1過表達可導致組蛋白去乙酰化。近年來，胰腺癌的輔助化療對緩解臨床癥狀，延長患者生存時間和提高生存質量有相當重要的意義。本實驗通過觀察HDAC的表達和TMS1/ASC啟動子區域甲基化的狀態研究吉西他濱(gemcitabine，GEM)治療胰腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI-1640培養液、胎牛血清購自Gibco公司;GEM購自Sigma公司;胰腺癌細胞PANC-1購自中科院上海細胞庫;蛋白抽提試劑盒購自Pierce公司;兔抗人HDAC-1多克隆抗體購自Santa Cruz公司;IgGHRP羊抗兔多克隆抗體購自北京中杉生物技術公司;HRP標記的β-actin單克隆抗體購自北京博奧森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與傳代:用0.25%的胰酶及0.02%的EDTA消化液消化PANC-1細胞，用含10%胎牛血清的1640培養基，在37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養，待細胞融合率達70%時，以0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。

1.2.2 GEM對PANC-1胰腺癌細胞內TMS1/ASC的誘導:細胞生長狀態良好時，取1×106/瓶傳代接種于2個裝有培養基的25 cm2培養瓶中，加入4.27 μg/ml GEM繼續培養，未加入GEM的細胞作為對照組。

1.2.3 透射電鏡觀察細胞形態:EP管中收獲細胞(5×106)，PBS洗滌2次。2%戊二醛固定樣品15 min后，4℃，二甲胂酸鈉緩沖液洗滌3次，15 min/次，接著1%鋨酸固定30 min。然后PBS洗滌2次，5 min/次，再進行梯度脫水:20%、30%、50%、70%、90%乙醇分別于4℃下脫水2 min，100%乙醇室溫下脫水2 min，100%乙醇4℃下脫水2 min。室溫下滲透，丙酮:環氧樹脂(1∶1)作用60 min，100%樹脂作用60 min。37℃包埋12 h，60℃聚合48 h。在超薄切片機上先制成半薄切片，光鏡下定位再制成超薄切片，醋酸鈾染色10 min(避光)后，立即進行載網檸檬酸鉛染10 min。然后用0.02 mol/L NaOH洗1次，雙蒸水洗2次，濾紙吸水后，將銅網置于鋪有濾紙的平皿中，半掩皿蓋，燈下烘干保存。電鏡下觀察并拍攝照片。

1.2.4 HDAC-1蛋白水平檢測:提取各組細胞總蛋白。取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移2 h后轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人HDAC-1多克隆抗體(1∶1000，Santa Cruz公司)，4℃孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗(1∶2000)，室溫輕搖2 h，洗膜，加入增強化學發光(ECL)反應液，暗室顯影、定影后掃描。以β-actin作為內參照。

1.2.5 TMS1/ASC基因啟動子區甲基化檢測:按照DNA提取試劑盒(美國Omega公司)說明書提取細胞基因組DNA，進行重亞硫酸鹽處理。具體步驟:取DNA約4 μg稀釋至50 μl，加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，37℃變性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的對苯二酚及520 μl 3 mol/L NaHSO3(以10 mol/L的NaOH調整pH值至5.0)，混勻，避光，置于50℃水浴16 h。應用Wizard DNA純化試劑盒(Promega公司)純化修飾后的DNA。于室溫下加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，放置15 min。加入2 μl 10 mg/ml糖原，66 μl 10 mol/L乙酸銨及450 μl冰乙醇過夜，離心，洗滌，室溫下干燥，加60 μl TE(pH 8.0)溶解，-20℃保存。甲基化酶處理基因組DNA按照試劑說明操作步驟進行，使雙鏈DNA上的胞嘧啶全部甲基化。

1.2.6 結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)檢測:以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板進行PCR擴增。反應體系:樣品DNA 2 μl，10倍緩沖液5 μl，上下游引物各2 μl，dNTP 2.5 μl，Fast-Taq酶0.2 μl，去離子H20 36.3 μl。在Touchdown—PCR儀上進行擴增。反應條件:95℃5 min，94℃30 s，68℃30 s，72℃30 s，2個循環;94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，3個循環;94℃30 s，64℃30 s，72℃30 s，4個循環;94℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，30個循環。以甲基化酶(SSSI)處理或未處理的正常人的外周血細胞DNA分別作為陽性和陰性對照。取部分PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，Bio-Rad自動成像儀成像。取部分PCR產物進行HhaI酶切，反應體系:PCR產物10 μl，去離子H2O 18 μl，10倍緩沖液Tango 2 μl，Hhal 2 μl，酶切8 h后行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，EB染色，攝片。Quantity One軟件進行灰度分析，并計算甲基化率。

1.3 統計學處理計量數據以均數±標準差表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。所有多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GEM對胰腺癌細胞PANC-1形態的影響GEM刺激PANC-1 24 h后，電鏡發現細胞出現明顯凋亡的形態學變化，絕大多數細胞發生核質疏松，核膜分層、起泡甚至破裂，核質溢出，胞漿也出現空泡，細胞膜和細胞器明顯改變。見圖1。

2.2 GEM刺激胰腺癌細胞PANC-1中HDAC的表達與對照組相比，經過GEM誘導的PANC-1中HDAC表達顯著降低，并隨誘導時間的延長其表達不斷降低。見圖2。

2.3 TMS1/ASC基因啟動子區的甲基化狀態甲基化率(%)=lane2/(lane1+lane2)×100%，因產物被酶切為52、53bp，故酶切后為兩條帶。對照組和GEM處理組TMS1/ASC基因啟動子區的甲基化率分別為94.2%和17.3%，與GEM組比較，對照組TMS1/ASC基因啟動子區的甲基化率明顯升高(P＜0.01)。見圖3。

圖1 PANC-1細胞形態電鏡照片(×6000)

圖2 胰腺癌細胞PANC-1中HDAC的表達

圖3 5-雜氮-2'-脫氧胞苷處理前后胰腺癌PANC-1細胞株COBRA圖

3 討論

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統腫瘤，進展迅速，高度侵襲，化療是胰腺癌綜合治療中的重要輔助手段之一，對化療藥物的正確選擇將直接影響療效，加之胰腺癌化療極易出現耐藥，胰腺癌臨床治療面臨嚴峻的考驗［1］。GEM作為一種脫氧胞苷類抗腫瘤藥物，對實體瘤具有良好的抗腫瘤活性［2-3］。目前已作為臨床惡性腫瘤化療的一線用藥。許多研究顯示，基因啟動子區CPG島高甲基化可以導致抑癌基因靜息，引起腫瘤的發生發展。死亡區域(DDF)的信號轉導途徑和激活機制是目前一項熱門研究課題，TMSl/ASC基因包含有N—端PYD和C—端CARD結構的蛋白［4］。包含這種結構的TMS1/ASC基因編碼蛋白可能在調節凋亡和免疫應答信號傳導途徑中起著關鍵作用。因此，由啟動子區域異常甲基化而導致TMS1/ASC基因沉默，甲基化CpG結合蛋白可以通過與HDAC復合體相互作用而實現其抑制作用可能對癌細胞逃避凋亡有利［5］。

本實驗采用透射電鏡、蛋白印跡法和MSP技術，電鏡結果顯示，GEM刺激PANC-1 24 h后，其內部形態發生劇烈改變，GEM具有顯著抑制胰腺癌PANC-1細胞增殖的作用。蛋白印跡法揭示HDAC在GEM誘導的胰腺癌PANC-1細胞中的表達明顯低于正常對照組，胰腺癌細胞株PANC-1中TMS1/ASC的啟動子發生高頻率的甲基化，通過基因啟動子區域的甲基化導致TMS1/ASC沉默有利于胰腺癌細胞逃避凋亡，從而可能在胰腺癌的發生中起了一定的作用。GEM作為胰腺癌治療的一線藥物，可以通過抑制TMS1/ASC發生甲基化起到化療的效果，也可以通過監測其甲基化的表達狀態來觀察化療耐藥情況，TMS1/ASC基因表達的下降可導致腫瘤細胞對化療藥物敏感性下降。HDAC-1表達沉默后可使DNA組蛋白處于乙酰化狀態，使DNA易于解聚，染色質呈轉錄活性結構，有利于轉錄因子與DNA模板相結合，進而激活一系列有關增殖凋亡調節、細胞分化的抑癌基因［6］。GEM治療胰腺癌可能通過抑制TMS1/ASC甲基化和促進組蛋白乙酰化來發揮其化療的作用。

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［4］Matin SJ.Dealing the CARDs between life and death［J］.Trends Cell Bio，2001，11(5):188.

［5］閆紅杰，齊暉，王云帥，等.組蛋白去甲基化酶1在干細胞增殖與分化中的調控作用［J］.生命科學，2012，24(7):646-653.

［6］高道鍵，徐岷，張玉琦，等.組蛋白去乙酰化酶1對人胰腺癌細胞增殖凋亡的影響［J］.中華消化雜志，2009，29(3):525-528.