環氧化酶2基因多態性與中國漢族人群缺血性腦卒中及其亞型的關系研究

陳忠云，李珊珊，李 婧，徐志偉，楊 旭

腦卒中已成為我國居民死亡的首要原因[1]，其中約80%是缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)[2]。新近研究表明，炎性反應在IS的發病機制中發揮重要作用，編碼炎性分子的基因變異可能影響IS的發生、發展過程[3-4]。環氧化酶(cyclooxygenase，COX)作為催化花生四烯酸合成各種內源性前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，通過其代謝產物前列腺素E2(PGE2)來調節炎性反應[5]。COX在人體內主要存在COX-1和COX-2兩種亞型。COX-2為誘導型，只在炎癥及細胞因子等刺激因素誘導下生成。已有研究表明COX-2基因多態性與IS密切相關[6-7]，但亦存有爭議[4,8]。Kim等[9]研究指出，不同病因的IS可能存在不同的遺傳背景，忽略這種差異可能會得到矛盾的結論。基于此，本研究擬探討COX-2基因兩個基因多態性位點(-1195G>A和-765G>C)與IS及其亞型的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 于2011年12月—2013年7月連續收集入住航天中心醫院(北京大學航天臨床醫學院)神經內科的IS患者355例。IS定義為由腦缺血而引起的突發的持續時間超過24 h的局灶性或全腦神經功能損傷，并經顱腦磁共振成像(MRI)或計算機斷層掃描(CT)證實。根據1993年TOAST診斷標準[10]對IS進行病因學分型：大動脈粥樣硬化性卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)93例、心源性腦梗死(cardioembolism，CE)52例、小動脈閉塞性卒中或腔隙性卒中(small vessal occlusion，SVO)117例、其他原因(stroke of other determined etiology，SOD)43例及不明原因(stroke of undetermined etiology，SUD)50例。本研究共納入SVO患者117例(SVO組)和LAA患者93例(LAA組)作為IS組，其中男123例、女87例，平均年齡(61.6±12.1)歲。患者均在發病5 d內入選。同期從體檢中心采用簡單隨機抽樣法選取266例體檢健康者作為對照組，男160例、女106例，平均年齡(62.1±10.8)歲。排除嚴重感染、骨髓增生異常綜合征、惡性漿細胞病、腫瘤、肝病、腎病等患者。入選受試者均為中國漢族人，并居住在北京地區。本研究協議經我院倫理協會和醫院倫理委員會審查批準，受試者均簽署知情同意書。

1.2 資料收集與檢測指標 本研究采用病例對照研究。對受試者進行問卷調查，收集危險因素，包括高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙、飲酒、體質指數(BMI)等資料。如果患者無法溝通，通過其直系親屬采集病史資料。

于患者住院次日清晨空腹抽取肘靜脈血4 ml，用全自動分析儀測定低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)。

1.3 基因提取及分型 于患者住院次日清晨空腹抽取肘靜脈血2 ml抗凝(枸櫞酸鈉和EDTA-K2聯合抗凝)，按照DNA提取試劑盒(TIANGEN)操作，提取全血標本DNA。提取的基因組DNA于-80 ℃保存備用。運用擴增阻滯突變系統(ARMS)結合熒光探針(TaqMan)技術的方法(ARMS-TaqMan)，采用ABI公司的TaqExpress軟件(ABI，Foster City，CA)設計引物和探針，由北京賽百盛生物技術公司合成。測定的基因型均通過測序法進行驗證。-1195 G>A位點突變擴增片段長度119 bp，引物3′端-2位引入錯配堿基“T”(正配堿基應為“A”)，-765 G>C位點突變擴增片段長度116 bp，引物3′端-2位引入錯配堿基“T”(正配堿基應為“C”，見表1)。

ARMS-TaqMan法的PCR反應體系及測定條件：反應體系20 μl，包括：反應液8 μl，上、下游引物各1 μl，增強液1 μl，探針1 μl，H2O 6 μl，模板2 μl；使用7500熒光定量PCR測定儀(美國ABI公司)檢測探針羧基熒光素的熒光信號。-1195 G>A、-765 G>C位點突變反應條件為94 ℃ 5min，94 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s 40個循環，以2～9個循環為基線和閾值0.02確定循環閾值(Ct值)。

ARMS-TaqMan法檢測不同基因型判定標準的建立：利用引物3′端與模板正配與錯配擴增效率不同，以已知濃度梯度不同基因型質粒標準品為模板，按上述反應條件，通過熒光信號檢測確定PCR反應有無指數擴增期和Ct值，確定可區分位點突變檢測的濃度范圍。在可區分位點突變檢測的濃度范圍內，記錄不同拷貝數的野生引物Ct值(Wct)和突變引物Ct值(Mct)，計算兩者差值Δct(Δct= Wct-Mct)，根據總體均數計算Δct的99%可信區間(Δct±2.58)及PCR擴增時有無指數增長期，建立各種等位基因型的判定標準。

表1 COX-2基因位點突變引物及探針序列

注：序列中加_的堿基是引入的錯配堿基，用以增加引物特異性

2 結果

2.1 臨床資料比較 IS組高血壓、糖尿病患病率，吸煙率，飲酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平高于對照組(P<0.05)；SVO組高血壓、糖尿病患病率，飲酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平高于對照組(P<0.05)；LAA組高血壓、糖尿病患病率，飲酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平明顯高于對照組(P<0.05)；IS組、SVO組、LAA組HDL-C水平均低于對照組(P<0.05，見表2)。

2.2 COX-2基因-1195G>A和-765G>C基因型、等位基因分布頻率比較 -1195G>A和-765G>C基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.757,P=0.384；χ2=3.016，P=0.082)。

對照組與IS組COX-2基因-1195G>A位點基因型分布頻率及等位基因分布頻率間差異無統計意義(P>0.05)。與對照組-1195G>A位點GG基因型相比，AA基因型及攜帶A等位基因(GA+AA)發生SVO的風險更高〔OR=2.20，95%CI(1.15，4.22)，P=0.02；OR=1.67，95%CI(1.01，2.77)，P=0.04〕；行多因素Logistic回歸校正年齡、性別及傳統危險因素后，仍有統計學意義〔OR=2.18，95%CI(1.05,4.51)，P=0.04；OR=1.76，95%CI(1.01,3.11)，P=0.05〕。LAA組-1195G>A位點基因型分布頻率、等位基因分布頻率與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

對照組與IS組、LAA組、SVO組比較，COX-2基因-765G>C位點的基因型分布頻率間差異無統計學意義(χ2=0.30，P=0.86；χ2=0.24，P=0.89)，等位基因分布頻率在各組間差異亦無統計學意義(χ2=0.18，P=0.67；χ2=0.24，P=0.62，見表3)。

2.3 COX-2基因2個SNPs位點的單體型分布頻率比較 連鎖不平衡分析提示-1195G>A與-765G>C存在一定的連鎖不平衡(D′=0.52，r2=0.13)。2個SNPs共構建G-G、G-C、A-G、A-C 4個單體型，其中單體型G-G在IS組及對照組中頻率最大(48.1%和52.3%)。SVO組單體型A-G頻率高于對照組(41.1% 和32.7%)，差異有統計學意義〔OR=1.44，95%CI(1.05,1.97)，P=0.02〕。IS組和LAA組與對照組單體型分布頻率間差異無統計學意義(P>0.05，見表4)。

表2 各組受試者臨床資料比較

注：與對照組比較,*P<0.05；●為χ2值；△為對照組與IS組比較，▲為對照組與SVO組、LAA組比較；BMI=體質指數，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇

表3 各組受試者COX-2基因SNPs基因型、等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

注：▲與對照組比較

表4 各組受試者COX-2基因單體型分布頻率比較〔n(%)〕

Table4 Comparison of haplotypes frequency distribution of the COX-2 gene in each group

例數單體型*G-G G-C A-G A-C對照組266278(52.3)32(6.0)174(32.7)48(9.0)IS組210202(48.1)19(4.5)159(37.9)40(9.5)OR(95%CI)0.85(0.66,1.09)0.75(0.42,1.33)1.26(0.96,1.64)1.06(0.68,1.64)P值▲0.200.320.100.80SVO組117106(45.2)9(3.9)96(41.1)23(9.7)OR(95%CI)0.75(0.55,1.03)0.64(0.30,1.36)1.44(1.05,1.97)1.09(0.64,1.84)P值▲0.070.240.020.75LAA組9396(51.7)10(5.3)63(33.8)17(9.2)OR(95%CI)0.97(0.70,1.36)0.87(0.42,1.81)1.05(0.74,1.49)1.03(0.58,1.83)P值▲0.900.700.790.92

注：*表示單體型按照-1195G >A及-765G>C列出；▲與對照組比較

3 討論

本研究以中國漢族人群作為研究對象，探討COX-2基因-1195G>A和-765G>C與IS及其亞型的相關性，結果顯示-1195G>A和-765G>C基因型、等位基因頻率及其組成單體型與IS的發生均無相關性；校正相關危險因素后仍無統計學意義。進一步探討COX-2基因多態性與IS亞型的相關性，結果顯示-1195 AA基因型及攜帶A等位基因(AA+GA)與SVO有關，而與LAA無關；構建單體型，結果亦顯示單體型A-G與SVO相關。

人類COX-2基因位于1號染色體q25.2～q25.3，含有10個外顯子和9個內含子。在基礎條件下，COX-2基因表達是高度受限的，在正常生理情況下幾乎不表達，但在受到內外環境刺激時可使COX-2呈過度表達。COX-2基因-765G>C位點與-1195G>A位點均位于啟動子位置，既往研究表明，該位點突變能改變啟動子的活性從而影響COX-2的表達[11-12]。

既往關于COX-2基因-1195G>A位點的研究多局限在炎癥[13]和腫瘤[14]方面。本研究發現，與純合野生基因GG相比，A等位基因攜帶者患SVO的風險更大，這個結果與Chen等[6]的結論一致。但關于此位點的研究結論仍有爭議。國內學者杜丹華等[15]研究表明，該位點與IS及其亞型無相關性。Zhang等[12]研究發現，-1195G>A位點變異可以產生一個新的轉錄因子C-MYB結合位點，與G等位基因相比，A等位基因可以提高啟動子活性及COX-2 mRNA的表達。但是，COX-2基因多態性影響SVO的確切機制尚不清楚。已有研究發現，COX-2通過調節炎性反應在血栓形成中發揮著重要作用[16]。因此，猜測-1195G>A位點A等位基因攜帶者的COX-2水平升高，引起PGE2水平的升高，從而通過炎性反應促進SVO的形成，但仍需進一步研究。

Cipollone等[7]研究發現，COX-2基因-765G>C位點GC和CC基因型與卒中發病率降低相關，提出C等位基因可能為減少卒中發病率的遺傳保護性因子。然而，Kohsaka等[17]研究結果提示，與GG基因型相比，GC與CC基因型攜帶者發生卒中的可能性更大〔OR=1.34，95%CI(1.03,1.74)，P=0.03〕。本研究并未發現-765G>C位點基因型、等位基因頻率與IS及其亞型相關，這與Lemaitre等[4]研究結論相一致。Li等[8]針對-765G>C與IS是否存在相關性進行了Meta分析，共納入1 628例IS患者及17 653例對照，結果亦顯示，與GG基因型相比，GC與CC基因型攜帶者與IS的發生無相關性〔OR=1.11，95%CI(0.88,1.06)〕。

遺傳異質性可能是這些結論有爭議的原因之一。首先，本研究對照組-1195G>A的基因型頻率GG為32.3%，GA為51.9%，AA為15.8%，這與國內其他研究相一致(GG為24%，GA為48%，AA為29%)[15]，而與國外的研究相比該基因型分布頻率差異較大(GG為5%，GA為33%，AA為62%)[18]。同樣，此種差異在-765G>C位點亦較顯著[19]。其次，由于IS的病因不同，遺傳因素在不同亞型中發揮的作用也不同，關于這兩個位點與IS的研究，既往研究多未對IS進行分型，因此可能對研究結果產生了一定的影響。

總之，本研究提示，COX-2基因-1195G>A多態性及單體型A-G與SVO相關聯，但仍需擴大樣本并且在不同種族之間進一步分析-1195G>A對IS及其亞型發生的影響。

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