多肽pd20與腫瘤壞死因子α融合蛋白的純化及生物學活性鑒定

呼圣娟，姜榮興，師紅利，沈 皓，謝華紅

多肽pd20是本課題組在前期工作中篩選出的可特異性結合于胃癌肝高轉移潛能細胞的新多肽分子，實驗證實多肽pd20具有胃癌肝轉移的導向性[1-2]。為了探討此多肽是否具有攜帶抗癌藥物或抑癌基因靶向性治療胃癌肝轉移的作用，本研究前期工作已將多肽pd20與腫瘤壞死因子α(TNF-α)進行了基因融合，并構建了原核表達載體，對重組融合蛋白進行了誘導表達，此次實驗目的是將pd20-TNF-α融合蛋白進行純化，并對純化后的蛋白進行鑒定和生物學活性檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 小鼠成纖維細胞L929購自上海中科院細胞庫。胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L由本實驗組制備，保存于第四軍醫大學消化病研究所。

1.1.2 試劑和抗體類 Ni-NTA柱購自QIAGEN公司；蛋白Marker購自上海麗珠東風生物技術有限公司；鼠抗人TNF-α單克隆抗體購自Santa Cruz公司。RPMI 1640培養基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、PE Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒、Matrigel膠均購自BD公司。TNF-α標準品由中國藥品生物制品鑒定所提供。顯色試劑ABTS為Sigma 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白的純化和鑒定 將含融合基因pd20-TNF-α的大腸埃希菌BL21用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導培養4 h，13 000 r/min，離心半徑為6 cm，離心1 min，收集誘導表達后的菌體，按1 g菌體加7 ml裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，進行超聲波裂菌。收集上清液用鎳柱進行純化，具體步驟如下：(1)Equilibrium buffer平衡鎳柱；(2)將稀釋過濾后的溶菌上清液上樣；(3)Equilibrium buffer再洗5個床體積，使目標蛋白充分掛柱；(4)Elution buffer 1洗去雜蛋白，收集洗雜峰；(5)Elution buffer 2進行洗脫，并收集洗脫峰和洗脫液；(6)將收集的洗脫液用15 ml超濾離心管超濾濃縮，收集各次濃縮液合并后再次超濾濃縮，分裝備用；(7)各取1 ml過柱前、掛柱穿透、洗雜液、洗脫液進行活性測定和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 。

1.2.2 SDS-PAGE及Western blotting檢測 將樣品進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍R250染色。將樣品蛋白用電轉移法轉到硝酸纖維膜上，用鼠抗人TNF-α單克隆抗體為一抗，酶標兔抗鼠IgG為二抗，進行Western blotting分析。

1.2.3 生物學活性測定 采用L929 細胞毒法檢測pd20-TNF-α融合蛋白的生物學活性，步驟如下：調整小鼠成纖維細胞L929的細胞密度為1.0×105細胞/ml，接種于96孔培養板中，每孔100 μl，培養至細胞貼壁80%以上。TNF-α標準品起始濃度為100 U/ml，依次做4倍比梯度稀釋至終濃度6.25×10-3U/ml。樣品預稀釋起始濃度為100 U/ml，再做4倍比梯度稀釋，終體積均為100 μl。標準品和樣品每個劑量各測3個復孔，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱中培養16 h。用結晶紫染色，測OD570 nm值，以稀釋倍數的對數值為橫坐標，OD570 nm為縱坐標做圖，以標準品的最低OD570 nm和最高OD570 nm之平均值做一平行于X軸的直線交于曲線，以樣品對應曲線與該直線交點在X軸上讀出半效量的稀釋度，按以下公式計算樣品活性：樣品活性(U/ml)=標準品效價×(樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數)×(標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量的稀釋度)。

1.2.4 細胞凋亡實驗 將胃癌細胞XGC9811-L調整細胞密度為1.0×106個/ml，培養至貼壁80%以上。融合蛋白起始濃度為100.00 U/ml(A組)，做4倍比梯度稀釋，濃度依次為25.00 U/ml(B組)、6.25 U/ml(C組)。對照組為不加融合蛋白的陰性對照組(D組)和流式細胞凋亡的KB組(E組)。分別將不同濃度的融合蛋白加入胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L培養24 h。然后吸出至離心管內，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，加入胰酶進行消化。吸除胰酶，用離心法收集各組細胞，取(5～10)×104個/ml用PBS重懸的細胞，離心后棄上清液，加入195 μl磷脂結合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)結合液輕輕重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算細胞早期凋亡率，即Annexin V-FITC陽性細胞在總細胞數中的比例。每組設3個副孔，實驗重復3次，取均值進行分析。

1.2.5 細胞侵襲實驗 將Millicell小室放入滅菌的24孔板中；在小室內膜上加入Matrigel膠(100 μl/膜)，37 ℃ 4～5 h。用1%不完全培養液懸浮胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L，調整細胞密度為2.5×105細胞/ml，分別取200 μl與TNF-α(TNF-α組)、pd20-TNF-α(pd20-TNF-α組)各100 U在室溫下孵育1 h后加入小室內，將只加入等量XGC9811-L細胞(XGC9811-L組)或對照肽(對照肽組)作為對照。在下室中加入10%的完全培養液600 μl作為趨化劑用，37 ℃、5%CO2培養20 h；取出小室，棄去培養液，用棉簽擦去上室中的細胞，95%甲醇固定15 min 后，取下濾膜；固定后的濾膜進行Giemsa染色，中性樹膠封片，在40倍光鏡下計數膜背面侵襲的細胞數，隨機計數中間和四周共5個視野，每細胞計數3份，求出其平均值。相對侵襲指數=V2/V1×1，其中V2代表融合蛋白影響胃癌細胞的穿膜數，V1代表XGC9811-L組細胞的穿膜數。

2 結果

2.1 融合蛋白的純化和鑒定 通過Ni-NTA柱純化，其中目的蛋白在咪唑濃度為200 mmol/L時得到濃集。電泳普帶掃描分析表明蛋白純度可達92%。經Western blotting分析，純化的融合蛋白可以與抗TNF-α單抗相結合(見圖1)。

2.2 蛋白活性檢測 體外活性實驗顯示：pd20-TNF-α融合蛋白對小鼠成纖維腺細胞L929的殺傷活性為7.6×106U/ml，標準品的殺傷活性為1×107(見圖2)。

2.3 細胞凋亡實驗結果 將不同濃度的pd20-TNF-α融合蛋白作用于胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L，A組細胞早期凋亡率為(9.04±0.08)%，B組為(6.96±1.21)%，C組為(5.99±0.02)%，D組為(0.73±0.02)%，E組為(0.01±0.00)%，各組細胞早期凋亡率比較，差異有統計學意義(F=2.57，P<0.05)；其中A組細胞早期凋亡率高于B組，B組亦高于C組，差異均有統計學意義(q值分別為2.08和3.06；均P<0.01，見圖3)。

2.4 細胞侵襲實驗結果 用Matrigel包被的Transwell小室觀察純化后的pd20-TNF-α融合蛋白對胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L的體外侵襲能力的影響：pd20-TNF-α組、TNF-α組、XGC9811-L組、對照肽組單位時間內的穿膜細胞數分別為(26.5±5.9)、(36.0±3.2)、(63.5±5.0)、(64.0±6.8)個，4組間差異有統計學意義(F=49.87，P<0.01)；其中pd20-TNF-α組、TNF-α組單位時間內的穿膜細胞數少于XGC9811-L組(q值分別為19.5和14.6；均P<0.01)和對照組(q值分別為19.7和14.9；均P<0.01)；而pd20-TNF-α組與TNF-α組比較，XGC9811-L組與對照肽組比較，差異均無統計學意義(q值分別為4.25和0.75，均P>0.05，見圖4)。

注：MK為標準蛋白marker；1為過柱前；2為掛柱穿透；3為洗雜液；4～8為洗脫液(咪唑濃度分別為50、100、200、500 mmol/L)；9為Western blotting 檢測

圖1 Ni-NTA柱純化結果

Figure1 The purification result of Ni-NTA

注：橫坐標表示蛋白的稀釋度

圖2 pd20-TNF-α融合蛋白生物學活性檢測結果

Figure2 The biological activity of fusion protein pd20-TNF-α

注：PI=碘化丙啶，Annexin V=磷脂結合蛋白V；A、B、C pd20-TNF-α融合蛋白的濃度分別為100.00、25.00、6.25 U/ml；D為陰性對照組，未添加藥物；E為流式細胞凋亡所使用的KB組；F為不同組的胃癌細胞早期凋亡率

圖3 胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L凋亡實驗

Figure3 Apoptosis test of high level hepatic metastasis from gastric cancer-related potential cell XGC9811-L

注：與XGC9811-L組比較，*P<0.01；與對照肽組比較，△P<0.01

圖4 各組胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L相對侵襲指數比較

Figure4 Comparison of relative invasive indexes of high level hepatic metastasis from gastric cancer-related potential cell XGC9811-L among various groups

3 討論

TNF是一種由活化的單核細胞/巨噬細胞產生的具有多功能的炎性遞質，是迄今為止人們發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子[3]。隨著20世紀80年代中期重組TNF-α的獲得，人們開始探索TNF-α在腫瘤治療中的作用。近年發現，TNF-α對體外多種腫瘤細胞株包括胃癌細胞在內有明顯的細胞毒性，但由于所用的治療劑量大，導致毒副作用嚴重[4-5]。因此，如何提高TNF-α的治療作用，降低其毒副作用成為TNF-α能否作為抗腫瘤藥物的關鍵性問題。

分子靶向治療是近年來在治療血液病和實體腫瘤中涌現出的新的治療手段[6-7]，其關鍵是要找到具有腫瘤導向性的靶向載體，以攜帶抗癌藥物或抑癌基因起到全身用藥、局部發揮的作用，減少毒副作用的發生[8]。多肽pd20是本課題組在前期工作中篩選出的可與胃癌肝高轉移潛能細胞及胃癌肝轉移組織相結合，并在裸鼠體內可歸巢于胃癌肝轉移組織，具有胃癌肝轉移導向性的新多肽分子[1-2]。為了提高TNF-α在癌組織中的有效治療濃度并避免進入循環系統引起嚴重毒副作用，本研究前期工作中已將胃癌肝高轉移潛能細胞導向肽pd20與TNF-α進行了基因融合，構建了原核表達載體，此次實驗的目的是對融合蛋白進行純化并對純化后的蛋白進行生物學活性檢測。

鎳柱組氨酸標簽親和層析純化試劑盒是被公認的高效的蛋白純化系統[9]，其純化標簽為6個組氨酸，每個組氨酸含有一個咪唑基團，這個化學結構帶有很多額外電子，可親和鎳、鋅、鈷等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結合，在低pH下用咪唑競爭洗脫。本研究中表達載體pet28a(+)帶有his標簽，這個標簽在pH 8.0時不帶電，且無免疫原性，對蛋白質的分泌、折疊基本上無影響，可高度親和鎳離子，使融合蛋白進行鎳柱純化成為可能。TNF-α有157 個氨基酸殘基，約17 kD，沒有糖基化，分子內有一個二硫鍵，對維持其空間結構有意義。故本研究中用不同濃度的咪唑洗脫pd20-TNF-α融合蛋白時，在其中加入少量的蛋白酶抑制劑，這既有利于洗脫，也會避免標簽被折疊進二級結構里[10]。結果顯示，在咪唑濃度200 mmol/L時得到條帶單一的濃集蛋白，經檢測其純度可達92%，并具有與抗TNF-α單抗結合的能力。

為了進一步驗證純化后的融合蛋白是否具有TNF-α的殺傷活力，本研究先對融合蛋白進行了體外活性檢測，純化得到的目的蛋白pd20-TNF-α殺傷活性為7.6×106U/ml，證實了融合蛋白兼有TNF-α的殺傷活性。多肽pd20是具有胃癌肝臟導向性的多肽分子，在凋亡實驗和侵襲實驗中選擇了胃癌肝高轉移潛能細胞XGC9811-L，觀察融合蛋白pd20-TNF-α是否會對此細胞的轉移能力產生影響。結果顯示：融合蛋白pd20-TNF-α具有促進胃癌肝高轉移潛能細胞凋亡和抑制胃癌肝高轉移潛能細胞侵襲的能力，間接證實了融合蛋白pd20-TNF-α可能兼有胃癌肝轉移的導向性，為下一步裸鼠體內鑒定實驗和開發抗胃癌肝轉移新的靶向藥物奠定了實驗基礎。

1 Hu S，Guo X，Hie H，et al.Phage display selection of peptides that inhibit metastatic ability of gastric cancer cells with high liver-metastatic potential[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341(4)：964-972.

2 呼圣娟，郭新寧，趙進，等.胃癌肝高轉移潛能細胞噬菌體結合肽的特異性鑒定[J].現代腫瘤醫學，2005，13(2)：158-160.

3 Van Ostade X，Vandenabeele P，Everaerdt B，et al.Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor [J].Nature，1993，361(6409)：266-269.

4 Mao W，Zhu X，Tang D，et al.TNF-α expression in the UCB-MSCs as stable source inhibits gastric cancers growth in nude mice[J].Cancer Invest，2012，30(6)：463-472.

5 Shaw J，Chen B，Huang WH，et al.The small-molecule TNF-alpha modulator，UTL-5g，reduces side effects induced by cisplatin and enhances the therapeutic effect of cisplatin in vivo[J].J Exp Ther Oncol，2011，9(2)：129-137.

6 Fulda S.Molecular targeted therapies for rhabdomyosarcoma：focus on hedgehog and apoptosis signaling[J].Klin Padiatr，2013，3(2)：76-79.

7 Lin ZK，Zhang R，Ge Z，et al.Characteristics of 4 specific target antigens in adult acute lymphoblastic leukemia[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2013，21(2)：289-295.

8 Almhanna K.Targeted therapy for gastric adenocarcinma[J].Adv Pharmacol，2012，65：437-470.

9 Schafer F，R?mer U，Emmerlich M，et al.Automated high-throughput purification of 6xHis-tagged proteins[J].J Biomol Tech，2002，13(3)：131-142.

10 Tropea JE，Cherry S，Nallamsetty S，et al.A generic method for the production of recombinant proteins in Escherichia coli using a dual hexahistidine-maltose-binding protein affinity tag[J].Methods Mol Biol，2007，363：1-19.