逍遙散對慢性束縛應激肝郁脾虛證模型大鼠SP、VIP基因表達的影響*

李曉紅,梁 媛,謝宇晴,黎 強,楊力強△

(1.廣西中醫藥大學，南寧 530001； 2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所, 北京 100700)

肝郁脾虛證是肝失疏泄、脾失健運所致的中醫證候。近年來很多學者從腦腸互動角度認識肝郁脾虛證的病理機制，腦腸肽同時分布于中樞神經系統和胃腸道，是反映腦腸互動的關鍵因素。逍遙散始載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白術、白芍、生姜、甘草、薄荷、茯苓、當歸8味藥物組成，是調和肝脾的代表方。本實驗通過慢性束縛應激[1]方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，觀察模型大鼠中樞海馬、杏仁核和外周胃、結腸組織中腦腸肽SP、VIPmRNA表達的變化及逍遙散的調節作用，為肝郁脾虛證的腦腸互動機制及逍遙散的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SD雄性大鼠30只，體質量(200±20)g，購自廣西醫科大學動物實驗中心，適應性飼養1周后按體質量隨機分為正常對照組、模型組、逍遙散組,每組各10只。動物每籠5只群養，光照節律12L∶12D (6∶00～18∶00)，飼養于普通級動物房，室內溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持為30%，大鼠喂常規飼料及飲用水。

1.2 中藥及制備

實驗所用中藥復方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散(柴胡30 g，當歸30 g，白芍30 g，白術30 g，茯苓30 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g)，中藥飲片購自廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/ml，4℃冰箱保存。

1.3 儀器與試劑

PCR儀為ABI7500 Real-Time PCR System，RNA提取試劑盒Trizol、反轉錄試劑盒SuperScript III Reverse Transcriptase由Invitrogen公司提供，PCR 試劑盒SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)由Takara公司提供。

1.4 模型制備及藥物干預

將模型組和逍遙散組大鼠進行捆綁束縛造模，隨機選取束縛時間點，每日3 h, 連續21 d。正常對照組大鼠不予束縛，自由進食、飲水及自主活動。自造模第1天開始，每日在束縛前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠用藥量為16.7 g/(kg·d)，灌胃容積為1 ml/100 g體質量，正常組、模型組大鼠每日灌服同等換算量的生理鹽水。造模期間根據大鼠體質量調整給藥量。

1.5 取材

造模21 d結束后取材標本，各組大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射進行深度麻醉(0.4 ml/100 g體質量)，將大鼠斷頭，取海馬、杏仁核和胃(胃竇組織距幽門0.5 cm處)、結腸組織(距肛門7～10 cm處)，胃、結腸組織用預冷的生理鹽水沖洗處理，所有標本放入液氮速凍后移入-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.6 檢測

實時熒光定量PCR法檢測海馬、杏仁核、胃、結腸組織SP、VIP表達

1.6.1 組織總RNA提取 按照Trizol試劑盒方法提取海馬、杏仁核、胃、結腸組織總RNA ,把提取的總RNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳進行電泳，觀察其完整性。NanoDrop 8000分光光度儀測定總RNA的濃度和純度，所有樣品的A260/A280比值均在1.83～2.03范圍之間，滿足實驗要求。總RNA 于-80℃保存備用。

1.6.2 PCR引物序列設計 引物由ABI Primer Express v 2.0軟件設計，序列由生工生物工程有限公司合成。引物序列如下： SP(forward: 5’ATCGGTGCCAACGATGATCT3’， reverse：5’CCGTTTGCCCATTAATCCAA3’，150 bp)，Vip(forward: 5’CCAGAAGGAAAGACCCAAGGA3’ reverse：5’CCTGTCATCCAACCTCACTGAA3’，150 bp)，GAPDH(forward: 5’AGGAGTCCCCATCCCAACTC3’， reverse：5’TTTTGAGGGTGCAGCGAACT3’， 140 bp)。

1.6.3 RNA反轉錄合成cDNA 采用20 μL反應體系，取總RNA5μg，加入Random primer 1 μl，dNTP (10 mM) 1 μl，加入ddH2O使總體積達到13 μl，混合后65℃加熱5 min，立即冰浴1～2 min；加入5×First strand buffer 4 μl，0.1 M DTT 1 μl，RNaseOUT 1 μl，SuperScript III RT 1 μl，充分混勻，25℃孵育5 min；50℃孵育60 min；70℃加熱15 min，以滅活SuperScript III RT。

1.6.4 實時- 熒光定量PCR反應 按照SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明進行實時熒光定量PCR檢測，通過收集熒光強度信號的變化來檢測循環閾值(cycle threshold, Ct)，由ABI7500 Real-Time PCR System監測。20 μl反應體系組成為SYBR Premix Ex Taq II(2X) 10 μl、引物各0.8 μl、ROX reference dye II (50 X) 0.4 μl、 cDNA模板0.25 μl、加入ddH2O補足至總體積20 μl。反應條件：第1步：預變性95℃ 1min；第2步：變性95℃ 10 s， 60℃ 32 s，40個循環；第3步：溶解曲線，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，終止反應，降溫至 4℃。SP、VIP mRNA的表達用2-△△Ct計算其相對表達量[2]。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結腸組織SPmRNA表達的變化

表1顯示，與正常對照組比較模型組大鼠海馬、結腸組織SPmRNA表達顯著升高(P<0.01)，杏仁核、胃組織SPmRNA表達無明顯變化；與模型組比較逍遙散組大鼠海馬、結腸組織SPmRNA表達顯著降低(P<0.01)，杏仁核SPmRNA表達略降低(P>0.05)，胃組織SPmRNA表達無明顯變化。

表1 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結腸組織SPmRNA表達的變化

注：與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01

2.2 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結腸組織VIPmRNA表達的變化

表2顯示，與正常對照組比較模型組大鼠海馬VIPmRNA表達顯著升高(P<0.01)，杏仁核、胃組織VIPmRNA表達顯著降低(P<0.01或P<0.05)，結腸組織VIPmRNA表達有下降趨勢(P>0.05)；與模型組比較，逍遙散組大鼠海馬VIPmRNA表達顯著降低(P<0.01)，杏仁核、胃組織VIPmRNA表達顯著升高(P<0.01或P<0.05)，結腸組織VIPmRNA表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠海馬、杏仁核、胃、結腸組織VIPmRNA表達的變化

注：與正常組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較：＊P<0.05，＊＊P<0.01

3 討論

腦腸肽不僅存在于胃腸道內分泌細胞、腸神經系統(ENS)，也存在于中樞神經系統(CNS)中，腦腸肽可通過體液途徑或作為腸道神經系統遞質在外周對胃腸運動功能進行調節，還可通過影響迷走神經環路在中樞水平發揮作用[3]，對胃腸功能、人類情感、行為等產生影響[4]，是認知和情感中樞與神經內分泌、腸神經系統和免疫系統相聯系的雙向交通通路的分子基礎[5]。腦腸肽的增多和減少可引起胃腸道、免疫、神經功能失調而致疾病發生。SP、VIP是兩種重要的腦腸肽，在探尋胃腸動力變化的物質基礎中研究較多[6,7]。

SP為速激肽家族中含11個氨基酸殘基的多肽,在全身均有分布,以胃腸道和中樞神經系統濃度最高。SP在中樞和外周神經系統均為興奮性神經遞質,一般認為SP是一種傳遞傷害性信息的神經肽。在ENS中, SP可增加胃腸蠕動,有強烈促消化道平滑肌收縮、加強結腸的集團推進運動、刺激小腸、結腸黏膜分泌水和電解質作用[8]，還可刺激內臟血管擴張并介導內臟疼痛[9], 發揮使肥大細胞釋放組胺、漿液外滲、影響巨噬細胞和白細胞等外周生理調節作用[10]，是一種主要的促炎癥性感覺性神經肽[11]。腦內SP參與感覺、運動和情緒等調節，并與焦慮癥、抑郁癥等精神疾病的發病機理有關[12]。SP能引起正常人產生與抑郁癥病人相似的情緒，導致睡眠和神經內分泌的改變，臨床上重癥抑郁癥病人血漿SP的循環水平升高，抗抑郁劑治療使之含量達到正常[13]。

VIP是一種含28個氨基酸殘基的堿基多肽, 屬于促胰液素-胰高血糖素家族，因其有明顯的擴張血管作用而被命名為血管活性腸肽。VIP作為胃腸動力抑制性神經元,可引起胃容受性舒張，能抑制胃酸分泌， 松弛胃腸道平滑肌， 抑制結腸和直腸的緊張性。在中樞中，VIP與引起覺醒效應、提高體溫、攝食睡眠有關。近年來的研究表明，VIP可刺激垂體細胞分泌促腎上腺皮質激素(ACTH)而起到類似促皮質激素釋放激素(CRH)的作用,參與ACTH分泌的調節[14]。而Barazmji 等人發現,將ACTH注入側腦室對饑餓大鼠或自由攝食鼠能起到抑制食欲的作用[15]。VIP還能抑制促炎細胞因子的釋放，同時提高機體抗炎因子水平，維持促炎-抗炎因子水平[16]。

本次研究顯示，模型組大鼠SP、VIPmRNA表達在中樞和外周出現了異常分布，SP在海馬和結腸組織顯著升高，VIP在海馬顯著升高、杏仁核和胃組織顯著降低。實驗過程中觀察到，模型組大鼠出現情志抑郁、焦慮、飲食減少、體質量減輕、倦怠乏力、排便次數增加及大便稀軟等癥狀表現，可能與海馬SP、VIP和結腸組織SP的表達升高有關。 VIP在胃組織顯著降低，一方面可能由于促進了促炎細胞因子的釋放和增強了胃黏膜血管的收縮，從而使我們在實驗過程中不僅肉眼觀察到模型組大鼠胃部黏膜出現瘀血、水腫，光學顯微鏡下胃部黏膜中也見到大量的炎癥細胞滲出[17]；另一方面可能導致對胃的抑制作用減弱或消失,使胃出現過度的蠕動，胃的緊縮甚至痙攣則使有效的推動性運動減弱，也可能是加重肝郁脾虛證大鼠食欲下降的原因。上述實驗結果還顯示，逍遙散能降低海馬、結腸組織SP表達及海馬VIP表達，升高杏仁核和胃組織VIP表達，表明逍遙散對中樞和外周SP、VIP的變化都有調節作用。

綜上所述，課題組認為臨床上肝郁脾虛證病人表現出精神情志異常，以及出現納呆、噯氣、脘腹痛、腹脹、腹瀉等消化不良癥狀，可能與中樞和外周SP和VIP的變化有關，SP、VIP可能參與了肝郁脾虛證腦腸互動機制，但僅僅SP、VIP的變化是不能完全解釋肝郁脾虛證患者的臨床表現的，必定有眾多的腦腸肽參與肝郁脾虛證這一病理演變過程。近年來，系統生物學技術在中醫證候的研究中已得到廣泛的應用[18]，今后計劃借鑒系統生物學技術平臺對肝郁脾虛證及逍遙散進行深入研究，將有利于從整體上闡明肝郁脾虛證的腦腸互動機制及逍遙散治療肝郁脾虛證的作用機制。

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