HPLC法同時測定中藥菟絲子中五種黃酮類成分含量的研究

許曉嘉 徐麗媛 郭志勇 潘麗麗 袁少雄 郝 變 呂劍波 李向日

（北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102）

中藥研究

HPLC法同時測定中藥菟絲子中五種黃酮類成分含量的研究

許曉嘉 徐麗媛 郭志勇 潘麗麗 袁少雄 郝 變 呂劍波 李向日

（北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102）

目的：建立中藥菟絲子中金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量的高效液相色譜測定方法。方法：采用Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇-0.4%磷酸，紫外檢測器：檢測波長360 nm，流速為1 mL/min，梯度洗脫：0→60min→80min，甲醇的比例由25%→40%→60%，柱溫45℃，測定中藥菟絲子中5種黃酮類成分的含量。結果：色譜峰分離情況良好，菟絲子中5種化學成分在各自的濃度范圍內均具有良好的線性關系；加樣回收率為98.0%～102.2%，RSD為1.44%～2.63%。結論：所建方法簡便、準確，重現性好，可用于菟絲子藥材的質量評價。

HPLC；菟絲子；黃酮類成分

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta australis R.Br.或菟絲子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟種子[1]。中藥菟絲子是臨床上常用的補陽藥，始載于《神農本草經》，并被列為上品，具有補肝腎、益精明目、安胎等功效，是中醫補腎壯陽的要藥。現代藥理研究表明黃酮類成分具有增強生殖系統作用[2-4]，提高心血管系統功能，提高免疫力、抗氧化[2-4]、抗衰老[2-4]、抗癌[2-4]、保肝明目等作用，黃酮類成分是菟絲子的主要有效成分。目前文獻[5-6]報道菟絲子的黃酮類成分主要有金絲桃苷、紫云英苷、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2-1）β-D-芹糖苷等，因此本研究選擇菟絲子和南方菟絲子中共有五種單體黃酮，即金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素（化學結構式如圖1）作為指標性成分，建立其含量測定的方法。本文首次采用HPLC法對菟絲子中五種黃酮成分進行同時測定。

1 儀器、試劑與試藥

Waters液相色譜儀包括1525色譜泵，2489雙波長紫外檢測器，Breeze工作站；金絲桃苷（111521-200303）、紫云英苷（MUST-09030603）、槲皮素（100081-200907）、山柰酚（110861-200808）、異鼠李素（110860-200608）、綠原酸（110753-200413），購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇色譜純、磷酸（分析純）、甲醇分析純、娃哈哈純凈水。

菟絲子（批號：090215為樣品1，100523為樣品2）產地為黑龍江，河北光明飲片有限公司飲片廠供應；菟絲子（批號：110301為樣品3，090601為樣品4）產地內蒙古，哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠提供。樣品1和3為南方菟絲子（Cuscuta australis R.Br.），樣品2和4為菟絲子（Cuscuta chinensis Lam.），其中混有少量南方菟絲子（Cuscuta australis R.Br.）。所有樣品均經北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸；紫外檢測器：檢測波長360 nm；流速為1 mL/min；進樣量15μL，柱溫45℃。梯度洗脫：0→60 min→80 min，甲醇的比例由25%→40%→60%。

2.2 標準品溶液的制備 精確稱取金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素各1.00mg，甲醇定容于10 m L，作為標準品溶液，色譜圖見圖2。

2.3 供試液的制備 精密稱取菟絲子過60目粉末1.00 g，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，密塞稱重，回流提取2 h，冷卻后補重，經0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 標準曲線的繪制

2.4.1 金絲桃苷標準曲線的繪制 精確稱取金絲桃苷10.20 mg，定容于20mL，分別精密吸取0.1mL、0.4 mL、4 mL、6 mL、8 m L的原液定容于10 mL。原液和各稀釋液分別進樣25μL，以峰面積對質量作回歸曲線方程，經計算得y＝2 323 873x+173 893，r＝0.999 9。

2.4.2 紫云英苷標準曲線的繪制 精密稱取紫云英苷對照品9.96 mg，定容于20 mL，分別精密吸取0.125 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 m L、3.75 mL、5 m L的原液定容于10 mL。各稀釋液分別進樣20μL，以峰面積對質量作回歸方程，經計算得y＝2 802 318x-83 742，r＝0.999 9。

2.4.3 槲皮素標準曲線的繪制 精密稱取槲皮素對照品5.20 mg，定容于50 mL，分別精密吸取0.1 mL、0.6mL、5mL、10mL、15mL的原液定容于20 mL，原液和各稀釋液進樣20μL，以峰面積對質量作回歸方程，經計算得y＝4 178 732x+12 709，r＝0.999 9。

2.4.4 山柰酚標準曲線的繪制 精密稱取山柰酚對照品5.10 mg，定容于50 mL，分別精密吸取0.1 mL、0.4 mL、5 mL、10 mL、15 m L的原液定容于20 mL，原液和各稀釋液進樣20μL，以峰面積對質量作回歸方程，經計算得y＝4 477 936x-29 527，r＝0.999 9。

2.4.5 異鼠李素標準曲線的繪制 精密稱取異鼠李素對照品5.01 mg，定容于100 mL，分別精密吸取0.05 mL、0.2 mL、5 m L、10 m L、15 m L的原液定容于20 m L，原液和各稀釋液進樣20μL，以峰面積對質量作回歸方程，經計算得y＝4 681 860x-28 099，r＝0.999 9。

2.5 精密度考察 按“2.1”項下方法，各對照品溶液分別進樣10μL，測得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值，平行測定6份，其RSD分別為2.27%、2.22%、1.42%、1.72%和1.77%。

2.6 穩定性考察 按“2.3”項下方法制備供試品溶液1份。按照“2.1”項下液相條件，測定2、4、6、8、10、12、16、24 h內測得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值的峰面積。其RSD分別為3.05%、1.29%、2.57%、2.10%和1.03%。說明：供試品溶液在放置24 h內是穩定的。

2.7 重復性考察 按照“2.3”項下方法同時制備6份供試品溶液。照“2.1”項下方法分別進樣15μL，測得金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素的峰面積值的峰面積。其RSD分別為2.21%、2.21%、2.22%、2.21%和1.55%。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取菟絲子過60目粉末0.5 g，加入各對照品適量，按照“2.3”項下方法同時制備6份供試品溶液，照“2.1”項下液相條件進樣15 μL，記錄峰面積，計算含量和回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率結果

圖1 化合物的結構式

2.9 樣品的含量測定 取不同產地不同批次的菟絲子藥材，按照供試品溶液的制備方法得到樣品溶液，按照液相條件測定，色譜圖見圖2，結果見表2。

圖2 混合對照品和樣品的HPLC圖

表2 樣品含量測定結果（n＝3）

3 討論

3.1 指標性成分的選擇 本課題組在前期實驗中，采用LC-ESI-MSn方法，結合對照品，比較相對保留時間和特征碎片，對菟絲子中的成分進行了結構定性[12]，在定性過程中發現，紫云英苷和槲皮苷結構式相近（見圖1），紫云英苷的分子量和槲皮苷的分子量一樣，均為448，且二者的出峰時間一樣，但是在碎片離子中并未發現m/z303，而是m/z287，因此確定菟絲子中含有紫云英苷，不含槲皮苷。而以往有文獻把紫云英苷誤認為槲皮苷進行測定是不正確的。因此本實驗選擇金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素為指標性成分，同時使用金絲桃苷和紫云英苷同時作為指標性成分。

3.2 提取方法的優化 實驗中考察了超聲提取和加熱回流兩種方法對菟絲子中5種黃酮類成分含量的影響，發現加熱回流對異鼠李素的提取效率明顯優于超聲提取；同時對溶劑濃度（100%、80%）和加熱回流時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）進行了考察。最終確定80%甲醇50 mL，加熱回流2 h提取效果最好。

3.3 樣品含量測定結果比較 從樣品的含量測定結果可以看出中藥菟絲子中黃酮苷的含量要大于苷元的含量，而菟絲子中以金絲桃苷含量最高，南方菟絲子中以紫云英苷的含量最高；目前的文獻報道[13-16]，紫云英苷具有良好的藥理活性，同時菟絲子中紫云英苷含量也比較高，而現行的藥典中對菟絲子含量測定中僅規定了金絲桃苷的含量不得少于0.10%，有待繼續完善和提高。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學工業出版社，2010：290-291.

[2]王晟，秦達念.菟絲子總黃酮對大鼠睪丸曲細精管無血清培養所致細胞凋亡的保護作用[J].中國藥理學通報，2006，22（8）：984-987.

[3]柯江維，王建紅，趙宏.菟絲子黃酮對心理應激雌性大鼠海馬一下丘腦一垂體一卵巢軸性激素受體的影響[J].中草藥，2006，37（1）：90-92.

[4]Jianxiong Yang，Yali Wang，YuBao，et al.The total flavones fromSemen cuscutaereverse the reduction of testosterone level and the expression of androgen receptor gene in kidney-yang deficient mice[J].Journal of Ethnopharmacology，2008，119：166-171.

[5]陳素紅，范景，呂圭源，等.菟絲子不同提取部位對雌二醇致腎陽虛小鼠的影響[J].上海中醫藥大學學報，2008，6（22）：60-63.

[6]真國輝，姜波，包永明，等.菟絲子黃酮類組分對H2O2損傷PC12細胞的保護作用[J].中藥材，2006，29（10）：1051-1055.

[7]陳林林，吳春，李偉.菟絲子黃酮的抗氧化性能研究[J].食品工業科技，2008，11（29）：116-121.

[8]Feng-Lin Yen，Tzu-HuiWu，Liang-Tzung Lin，et al.Concordance between antioxidant activities and flavonol contents in different extracts and fractions of Cuscuta chinensis[J].Food Chemistry，2008，108：455-462.

[9]田春雨，薄海美，陳新新，等.不同產地菟絲子抗衰老作用的比較[J].遼寧中醫藥大學報，2009，4（11）：206.

[10]郭洪祝，李家實.南方菟絲子化學成分研究[J].北京中醫藥大學報，2000，23（3）：20-23.

[11]李更生，陳雅妍.南方菟絲子化學成分的研究[J].中國中藥雜志，1997，22（9）：548-550.

[12]Xian-Long Cheng，Li-Yuan Xu，Feng Wei，et al.Identification of raw Cuscutae Semen and its processed products by high performance liquid hromatography/diode-array detection/mass spectrometry（HPLCDAD-MS）combined with principle component analysis[J].Journal of liquid chromatography&Related Technoloqies，2013.online.

[13]Mayumi Kotani，Motonobu Matsumoto，Akihito Fujita，et al.Persimmon leaf extract and astragalin inhibit development of dermatitis and IgE elevation in NC/Nga mice[J].Journal of Allergy Clinical Immunology，2000，106：159-166.

[14]S.N.Park，S.Y.Kim，G.N.Lim，et al.Invitro Skin Permeation and Cellular Protective Effects of Flavonoids isolated from Suaeda asparagoides Extracts[J].Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2012，18：680-683.

[15]Lijuan Yang，Qianfeng Chen，Fei Wang，et al.Antiosteoporotic compounds from seeds of Cuscuta chinensis[J].Journal of Ethnopharmacology，2011：553-560.

[16]Olga Burmistrova，JoséQuintana，Jesús G.Díaz，et al.Astragalin heptaacetate-induced cell death in human leukemia cellsis dependent on caspases and activates the MAPK pathway[J].Cancer Letters，2011，309：71-77.

（2013-08-26收稿 責任編輯：王明）

Study on Simultaneous Determination of Five Kinds of Flavonoids in Seed of Semen Cuscutae by HPLC

Xu Xiaojia，Xu Liyuan，Guo Zhiyong，Pan Lili，Yuan Shaoxiong，Hao Bian，LV Jianbo，Li Xiangri
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To determine the content of five kinds of flavonoids in the seed of semen cuscutae，including hyperoside，astragalin，quercetin，kaempferol and isorhamnetin.Methods：The HPLCmethod was used to determine the contentof flavonoids in the seeds of semen cuscutae.The analysis was carried out on Agilent TC C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm），with MeOH-0.4% H3PO4asmobile phase，the flow rate of1mL·min-1and wave length at360 nm.The gradientelute time was0→60min→80min，and the proportion ofmethanol was 25%→40%→60%.at45℃.Results：Chromatographic peak separation was in good condition，and five kinds of flavonoids had good linear relationship respectively within their own scope of concentration；the recovery was 98.0%～98. 0%，RSD was 1.44%～2.63%.Conclusion：The established method is simple，accurate，and reproducible and can be used as the quality evaluation of semen cuscutae.

HPLC；Semen cuscutae；Flavonoids

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.029

國家自然基金項目（編號：81274081）

李向日（1972.11—），女，教授，博士生導師，主要研究方向為中藥炮制與質量控制研究，Tel：（010）84738616，E-mail：lixiangri＠sina.com