細(xì)菌培養(yǎng)法與核酸(熒光PCR法)檢測肺炎克雷伯菌的對比分析

楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337055)

·實(shí)驗(yàn)研究·

細(xì)菌培養(yǎng)法與核酸(熒光PCR法)檢測肺炎克雷伯菌的對比分析

楊劍，劉劍榮，黃永建

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337055)

目的探討培養(yǎng)及核酸檢測兩種不同方法進(jìn)行肺炎克雷伯菌檢測分析的相關(guān)性，為臨床提供及時(shí)準(zhǔn)確的結(jié)果。方法對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標(biāo)本，采用細(xì)菌培養(yǎng)法及核酸(熒光PCR法)檢測，結(jié)果進(jìn)行對比統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)對熒光PCR法的特異性和敏感性進(jìn)行研究。結(jié)果在68例痰標(biāo)本中肺炎克雷伯菌檢出的結(jié)果，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。對肺炎克雷伯菌標(biāo)本DNA檢測得擴(kuò)增產(chǎn)物，對非肺炎克雷伯菌無交叉反應(yīng)，其檢測敏感性為1×103copies/ml。結(jié)論熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法，具有很高的敏感性和特異性，檢測時(shí)間短，能為臨床診斷提供及時(shí)準(zhǔn)確的結(jié)果。

肺炎克雷伯菌；細(xì)菌培養(yǎng)法；熒光PCR法

克雷伯菌屬為腸桿菌科中一類有莢膜的革蘭陰性桿菌，本屬中肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷伯桿菌和鼻硬結(jié)克雷伯菌與人類關(guān)系密切。其中肺炎克雷伯菌占克雷伯菌屬感染的95%以上。該菌存在于人類腸道、呼吸道以及水和谷物。當(dāng)機(jī)體免疫力降低或長期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時(shí)，進(jìn)入人體可引起肺炎、尿路感染、敗血癥、傷口感染、腦膜炎等多種疾病[1，2]。

近十來年發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)，特別是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在臨床應(yīng)用上越來越受到青睞，且不斷在推廣，使得臨床細(xì)菌感染后快速、準(zhǔn)確診斷成為可能。本文對本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標(biāo)本，通過細(xì)菌培養(yǎng)及核酸PCR檢測兩種不同方法對肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測分析，比較兩種方法的相關(guān)性，同時(shí)對熒光PCR法的特異性和敏感性進(jìn)行觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源本院68例疑似肺炎克雷伯菌感染病人采集送檢的痰標(biāo)本密閉送檢，同一患者標(biāo)本多次分離同樣細(xì)菌按一株算。

1.2 儀器和試劑VITEK32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定，鑒定卡由生物梅里埃公司提供。肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)由上海之江生物科技股份有限公司提供。本科室PCR實(shí)驗(yàn)室已通過國家衛(wèi)生部驗(yàn)收。

1.3 方法

1.3.1 常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)檢測肺炎克雷伯菌將送檢的痰標(biāo)本分別接種于血平板、巧克力平板、中國蘭平板、TTC-沙氏。放于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。巧克力平板置5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)18～24h后做進(jìn)一步鑒定。并用標(biāo)準(zhǔn)株大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控株[3]。嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版操作[4]。

1.3.2 核酸檢測(熒光PCR法)嚴(yán)格按照肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)說明書進(jìn)行操作。包括標(biāo)本、對照品的核酸裂解處理，試劑配制，加樣，PCR擴(kuò)增，閾值設(shè)定，質(zhì)量控制，試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算。進(jìn)行定量檢測時(shí)，陽性參考品(1×107copies/ml)進(jìn)行10、100和1000倍梯度稀釋，試驗(yàn)結(jié)束后，儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 特異性試驗(yàn)將培養(yǎng)為肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、化膿性鏈球菌、白念珠菌的痰標(biāo)本分別用肺炎克雷伯菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法)進(jìn)行DNA提取檢測。

1.3.4 敏感性試驗(yàn)將肺炎克雷伯菌陽性參考品(1×107copies/ml)進(jìn)行10倍梯度稀釋成：106copies/ ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ml、101copies/ml，然后進(jìn)行DNA提取檢測[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩種方法的陽性檢出率比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出情況在68例痰標(biāo)本中肺炎克雷伯菌檢出的結(jié)果，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢出陽性33例，陰性35例，陽性率48.53%；熒光PCR法檢出陽性49例，陰性19例，陽性率72.06%。熒光PCR法檢出肺炎克雷伯菌的陽性率高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法。未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)陽性而熒光PCR法擴(kuò)增陰性標(biāo)本。見表1。

表1 兩種方法對68例痰標(biāo)本檢測肺炎克雷伯菌陽性率比較

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，χ2=3.93＞3.84=χ20.05(1)，P＜0.05，陽性檢出率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 特異性試驗(yàn)培養(yǎng)為肺炎克雷伯菌的痰標(biāo)本進(jìn)行DNA提取后，PCR方法檢測得7.06× 106copies/ml；而非肺炎克雷伯菌的痰標(biāo)本結(jié)果為低于檢測下限(＜500copies/ml)。表明熒光PCR法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)分別選取濃度為106copies/ml、105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、102copies/ ml、101copies/ml的標(biāo)本進(jìn)行DNA檢測，結(jié)果最低可檢出1×103copies/ml，與試劑說明書中產(chǎn)品性能指標(biāo)的最低檢測限：1×103copies/ml相符。

3 討論

目前，肺炎克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)院感染病原菌之一，多見于年老體弱或原有慢性支氣管-肺疾患者，亦可通過機(jī)械呼吸器、霧化器或各種導(dǎo)管而感染，筆者采用細(xì)菌培養(yǎng)法和熒光PCR法對肺炎克雷伯菌進(jìn)行檢測對比分析。結(jié)果表明，PCR檢測的陽性率高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩法有差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)結(jié)果表明熒光PCR法具有很高敏感性和特異性，與有關(guān)報(bào)道相符[6]。

培養(yǎng)法一直被認(rèn)為是檢測細(xì)菌最可靠的方法，但該方法操作復(fù)雜、技術(shù)要求嚴(yán)格、費(fèi)時(shí)；而細(xì)菌熒光定量PCR檢測技術(shù)具有很高的敏感性和特異性，不受細(xì)菌存活與否的限制，近年來廣泛應(yīng)用臨床標(biāo)本檢測,但該方法對實(shí)驗(yàn)條件和檢查技術(shù)要求較高，又因敏感性較高，容易受外界污染的影響而產(chǎn)生假陽性[7]。本實(shí)驗(yàn)中49例PCR陽性結(jié)果的標(biāo)本，筆者認(rèn)為不排除存在假陽性的可能。但未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)陽性而熒光PCR法擴(kuò)增陰性標(biāo)本。然而，PCR檢測的陽性率明顯高于常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法，分析原因可能還有：(1)采集標(biāo)本細(xì)菌量少，加之雜菌生長迅速所覆蓋；(2)患者采樣前已使用過抗菌藥物，抗菌藥物抑制了細(xì)菌生長，導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果陰性[5]。

肺炎克雷伯菌培養(yǎng)法一直是診斷克雷伯菌性肺炎的最可靠的方法，仍是目前主要的檢測手段。但細(xì)菌培養(yǎng)所需時(shí)間較長，對疾病的的診斷有一定的滯后。熒光PCR法核酸檢測具有不受病程影響、快速、敏感性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)[8，9]，作為一項(xiàng)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)出報(bào)告只需要4h[10]，可以及時(shí)為臨床提供病原學(xué)的診斷結(jié)果。雖然PCR能較早檢出病原菌，但不能進(jìn)行抗菌藥物的體外敏感試驗(yàn)，其在臨床的應(yīng)用還是受到一定的限制。加上PCR法要求在合格的PCR室進(jìn)行，具有一定的局限性。但熒光PCR法是目前臨床上檢測克雷伯菌性肺炎的最佳方法之一，有條件的醫(yī)院可以開展。

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Comparison between bacterium culture and real-time PCR in detection of Klebsiella pneumoniae

YANG Jian,LIU Jianrong HUANG Yongjian.Department of Clinical Laboratory,Pingxiang People’s Hospital,Pingxiang Jiangxi 337005,China

Objective To compare the correlation of bacterium culture and real-time PCR for Klebsiella pneumoniae detection.Methods A total of 68 suspected-infection sputum samples were taken and analyzed by both bacterium culture and realtime PCR to detect Klebsiella pneumoniae.The sensitivity and specificity of real-time PCR were also analyzed.Results The detection rate of Klebsiella pneumoniae by real-time PCR was significantly higher than that by bacterium culture[72.06%(49/68)vs. 48.53%(33/68),P＜0.05].The sensitivity of real-time PCR was 1×103copies/ml and there were no cross reactions with Klebsiella pneumoniae.Conclusion The positive rate of real-time PCR was higher than bacterium culture.The high sensitivity and specificity and the rapid turnaround time make real-time PCR valuable for effective clinical diagnosis.

Klebsiella pneumoniae;Bacterium culture;Real-time PCR

R446.5,R446.62,R378.99+6

A

1674-1129(2014)06-0692-02DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.015

2014-08-25；

2014-09-17)

楊劍，女，1983年6月出生，學(xué)士學(xué)位，主管技師，研究方向?yàn)榕R床免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)。