江西地區1927例骨髓捐獻人群HLA-A、B、DRB1的多態性探討

孫瑜，彭繼紅，李國良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

·論著·

江西地區1927例骨髓捐獻人群HLA-A、B、DRB1的多態性探討

孫瑜，彭繼紅，李國良

(江西省血液中心，江西南昌330077)

目的分析江西地區骨髓捐獻人群人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)A、B、DRBl等位基因的多態性分布特征。方法應用流式-序列特異性寡核苷酸探針方法(Flow-SSO)與直接測序法(SBT)檢測江西地區1927例骨髓捐獻者的HLA-A、B、DRBl基因座位，采用Arlequin3.5軟件計算HLA等位基因頻率、單倍型頻率和連鎖不平衡參數等。結果低分辨狀態下3個基因座分別檢出17、29和12個等位基因，3個座位分布頻率最高的等位基因分別是HLA-A*02(0.3064)、HLAB*40(0.1889)和HLA-DRBl*9(0.1917),最常見的單倍型為HLA-A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)。該人群HLA-A、B、DRBl等位基因在高分辨檢測情況下分布不符合Hardy-Weinherg平衡(P＜0.05)。結論江西地區骨髓捐獻人群HLA-A、B、DRBl等位基因和單倍型具有較高的遺傳多態性。

HLA；多態性；中華骨髓庫

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.004

人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人類最復雜的遺傳多態性系統[1]。其等位基因和單倍型頻率在不同人群中存在明顯差異，這些差異對人群的起源、進化、遷徙及與其他人群的親緣關系等研究具有重要意義[2]。

本研究中我們應用流式-序列特異性寡核苷酸探針方法(Flow-sequence specific oligonucleotide probe，Flow-SSO)與PCR-直接測序法(polymerase chain reaction-sequence-based typing,PCR-SBT)對2009-2011年1927名江西籍無親緣關系健康漢族個體骨髓庫捐獻人群進行了HLA-A、B和DRB1座位基因的高分辨分型，并對得到的數據進行了分析。

1 材料與方法

1.1 對象2009年至2011年健康、無血緣關系的江西本地漢族造血干細胞志愿捐獻者1927例，根據知情同意原則采集EDTA抗凝靜脈全血5ml。

1.2 DNA提取應用美國Gentra公司手工提取全血基因組DNA，嚴格按試劑盒說明書獲取DNA，使用紫外分光光度儀檢測DNA濃度與純度，調整至DNA濃度20～100ng/μl，純度1.7～2.0。

1.3 HLA-A、B和DRBl基因分型

1.3.1 Flow-SSO方法采用Flow-SSO分型試劑盒(德國諾詩康瀛公司)，嚴格按照試劑盒說明書操作，結果由Luminexl00 IS分析軟件自動判讀。

1.3.2 PCR-SBT方法對Flow-SSO方法顯示結果模棱兩可者采用PCR-SBT分型試劑盒(德國諾詩康瀛公司)，嚴格按照試劑盒說明書操作，結果由軟件自動判讀。

1.4 數據分析應用Arlequin3．5軟件[3]，采用最大數學預期值算法(expectation-maximization，EM)估算基因頻率和單倍型頻率，行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 HLA-A、B、DRBl基因頻率在A、B、DRBl座位的低分辨水平上分別檢出了17、29和12個等位基因，高分辨水平上分別檢出了45、82和46個等位基因。3個座位分布頻率最高的等位基因分別是A*02(0.3064)、B*40(O.1889)和DRBl*09(0.1917) (表1)。

表1 江西地區漢族HLA-A、B、DRBl座位等位基因及頻率(n=1927)

2.2 HLA-A*-B*-DRBl*單倍型頻率低分辨狀態下共觀察到646種單倍型，最常見者為A*02-B*46-DRBl*09(0.0721)(表2)；高分辨狀態下共觀察到1621種單體型，最常見者為A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01(0.0602)

表2 江西漢族頻率大于0.005的HLA-A＊-B＊-DRBl＊單倍型分布

2.3 Hardy-Weinberg平衡調查該群體的3座位基因，以高分辨結果判斷,三基因座的雜合度觀察值與期望值的差異均有統計學意義,顯示各位點基因型分布均偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)(表3)。

表3 三基因座Hardy-Weinberg平衡檢驗

3 討論

作為人類免疫系統的重要成員，HLA基因位于6號染色體短臂上，表達產物為細胞表面的肽受體，可以結合來自細胞內外的肽而形成HLA-肽復合物，抗原遞呈細胞將此復合物遞呈給T細胞，從而誘導T細胞分化發育，啟動免疫應答。

HLA基因有著明顯的人種分布特異性，已有許多關于其基因分布的報道[4,5]。目前，三座位單體型頻率被用于研究人種之間和民族之間的遺傳學差異[6],估計找到HLA匹配供者所需要骨髓庫供者數[7]等。

本研究中我們采用Flow-SSO基因分型技術及SBT技術與對中國江西地區1927名健康漢族個體進行HLA-A、B、DRBl座位基因分型，在低分辨水平上,江西地區漢族人群HLA-A、B、DRBl三個座位分別檢出17、29和12個等位基因，這些等位基因理論上可以組合成17×29×12共計5916種A*-B*-DRBl*單倍型，但實際只觀察到646種，占理論數的10.92%,而高分辨的單倍型所占理論數更少(1621/169740),該數據提示在江西地區人群中HLA單體存在顯著的連鎖不平衡，具體情況我們將另文討論。低分辨情況下，江西地區漢族人群中頻率大于0.01的三座位單倍型有16種，均由江西地區常見等位基因組成[8,9]，其中最常見的單倍型是A*02-B*46-DRBl*09，而高分辨的狀態顯示，該單倍型主要是由A*02∶07-B*46∶01-DRBl*09∶01構成，該數據與廣州人群相似[10],一方面提示攜帶這種單倍型的器官或造血干細胞移植患者在本地漢族人群找到HLA相匹配供者的概率較高，另一方面也提示江西人群與廣州人群可能存在地緣關系的相近之處。

從Hardy-Weinberg平衡檢驗來看,某些位點的基因分布偏離H-W平衡,在一些研究中也有報道[4,5]，這可能與罕見基因的干擾、樣本量、樣本選擇壓力等相關,該偏離有望隨著樣本量的進一步擴大而得到糾正,我室的結果推導出同樣的結論。我室曾對江西地區漢族人群的HLA中低分辨率結果行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結果顯示該人群均處于遺傳平衡狀態[8,9]，但對3個座位的高分辨基因型分布行Hardy-Weinberg平衡檢驗的結果則與之相反，說明高分辨細化了實驗結果，如使用HLA高分辨基因型驗證人群是否處于遺傳不平衡狀態，須獲得更多的HLA數據支持。有學者以超過12000例骨髓庫標本的數據研究[11]，其統計學分析表明，以該研究樣本數求單體型頻率，在單體型頻率低于0.000123時結果不一定可靠，唯一的解決之道是繼續增加樣本數，我們僅對1927份標本的高分辨結果進行H-W平衡檢驗，樣本量低應為最主要原因。

本研究對Flow-SSO結果模棱兩可者行SBT檢測，發現二者在中低分辨結果上吻合性相當好，顯示出Flow-SSO法為大批量標本HLA檢測的可行性方法。本研究還提示HLA配型實驗室除應加強質量控制外，應至少建立兩種HLA方法或常備兩種以上HLA分型試劑．以便相互驗證，同時證明PCR-SBT為HLA檢測之金標準。

有學者認為[11],評估干細胞資料庫質量和效益主要考慮兩個因素，供者HLA分型的準確性和初次查詢中病人配到HLA匹配供者的機會。根據人群特點，得出本地區干細胞資料庫HLA三座位單體型頻率數據，將有利于快速計算在骨髓庫中發現匹配供者的概率，評估骨髓庫供者的數量和民族背景的組成是否適用于臨床需要，對于制定長遠的骨髓庫發展計劃大有裨益。

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Analysis of HLA-A，B，and DRBl polymorphism of 1927 bone marrow donors in Jiangxi

SUN Yu,PENG Jihong,LI Guo-Liang.HLA Laboratory,Jiangxi Blood Center，Nanchang 330077,P．R．China

Objective To investigate allelic and haplotypic polymorphisms of human leukocyte antigen(HLA)genes at A，B and DRBl loci in native Han population of Jiangxi.Methods A total of 1927 unrelated Han ethnic individuals from Jiangxi regions were genotyped by Flow-sequence specific olignucleotide probe(Flow-SSO)and polymerase chain reaction-sequence-based typing(PCR-SBT)for HLA-A，B and DRBl loci.Allelic and haplotypic frequencies were estimated by maximum likelihood estimation method(EM)using Arlequin 3.5 software.Results A total of 17,29 and 12 alleles were observed at HLA-A，B and DRBl loci respectively.The most frequent alleles were A*02(0.3064),B*40(0.1889)and DRBl*9(0.1917).The most common haplotype was A*02-B*46-DRBl*09(0.0721).Conclusion The HLA-A，B and DRBl loci are highly polymorphic in native Han population of Jiangxi province.

Human leukocyte antigen(HLA)；Polymorphism；China Marrow Donor Program(CMDP)

R457.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0661-03

2014-09-30；

2014-11-05)

江西省科技支撐計劃項目(編號：BSA13700)

孫瑜，女，出生于1976年11月，醫學碩士，副主任技師，研究方向為免疫遺傳學。

李國良，男，出生于1968年11月，醫學碩士，主任醫師，研究方向為免疫遺傳學。