斑馬魚毒性檢測方法的優化及應用研究

李志，黃俊明

(廣東省疾病預防控制中心，廣東廣州510430)

·論著·

斑馬魚毒性檢測方法的優化及應用研究

李志，黃俊明

(廣東省疾病預防控制中心，廣東廣州510430)

目的通過優化斑馬魚急性毒性檢測方法，檢測和分析輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對斑馬魚的毒性作用，探討其在食品安全性檢測與評價中的應用前景。方法優化試驗用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗條件,觀察和記錄斑馬魚在不同濃度的輔酶Q、低聚果糖、雙酚A的試驗溶液中暴露48h的毒性反應和死亡情況，檢測和分析不同濃度的輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對斑馬魚的毒性作用。結果斑馬魚在劑量為100～1000mg/ L的輔酶Q試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應，輔酶Q對斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L；斑馬魚在劑量為100～1000mg/L的低聚果糖試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應，低聚果糖對斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L；斑馬魚在劑量為10mg/L的雙酚A試驗溶液飼養3h后開始出現毒性反應，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗溶液飼養6h后開始出現毒性反應，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗溶液飼養12h后開始出現毒性反應，雙酚A對斑馬魚的48hLC50為7.15mg/L。結論本研究顯示優化的斑馬魚急性毒性檢測方法能夠快速檢測食品和食品污染物的急性毒性，其在食品安全性檢測與評價中將有較好應用前景。

斑馬魚；急性毒性；雙酚A；優化

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.003

近年來，三聚氰胺、蘇丹紅、瘦肉精、塑化劑等食品安全事件的不斷涌現，食品安全問題無疑已成為民生問題中的重中之重。如何以已發生的食品安全事件為鑒，為人民群眾的飲食安全提供更好的保障已成為擺在我們面前的重大課題，如何建立快速、有效的毒性檢測方法，加強食品安全相關檢測和評價，已成為了目前最需要迫切解決的問題。

斑馬魚(zebrafish),又名藍條魚、花條魚、斑馬擔尼魚,屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔尼魚屬(Danio)的一種硬骨魚，是脊椎動物，具有近似人類的各種器官系統，采用斑馬魚作為實驗動物，與大、小鼠等實驗動物相比具有較強的優勢，而且以水生動物代替嚙齒類實驗動物可能是較好推動動物替代的方法之一。國際標準化組織在20世紀80年代推薦斑馬魚為毒性試驗的標準實驗用魚，目前斑馬魚已經列為健康毒性和環境毒性檢測實驗的標準魚類,試驗得出的數據可以在國際上認證[1]。

目前在我國尚無以斑馬魚模式動物為實驗動物進行食品安全性檢測與評價的檢測方法，雖然斑馬魚模式動物為搭建快速、有效的毒性檢測技術平臺提供了良好實驗動物基礎，但要將斑馬魚毒性檢測方法作為標準方法應用于食品安全性檢測與評價,還有待進一步完善和優化[2]。本研究擬優化試驗用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗條件，檢測和分析輔酶Q、低聚果糖、雙酚A對斑馬魚的毒性作用，探討優化的斑馬魚急性毒性檢測方法在食品安全性檢測與評價中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚斑馬魚來源于南方醫科大學，斑馬魚平均體長26.0±2mm，平均體重0.26±0.11g。

1.1.2 試劑二甲基亞砜(美國sigma)，輔酶Q(某生產廠家提供)，低聚果糖(某生產廠家提供),雙酚A (美國sigma)，標準稀釋水(按照GB 13267-91來配制)。

1.2 方法

1.2.1 試驗用斑馬魚的基本條件試驗魚種應是斑馬擔尼魚(真骨魚總目，鯉科)，試驗魚應無明顯的疾病和肉眼可見的畸形，試驗魚試驗前兩周內不應對其做疾病處理，試驗魚試驗前應在與試驗時相同的環境條件下馴養3周，馴養期間死亡率不得超過10%，如果超過10%，則該批魚不得用作試驗。試驗魚試驗前24h停止喂飼，試驗魚宜選擇體長30±5mm、體重0.3±0.1g健康且個體差異不大且同一魚群的斑馬魚[1，2]。

1.2.2 非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求試驗當天配制受試物試驗溶液，水溶性受試物可溶于一定體積的標準稀釋水、去離于水或蒸餾水中；水中溶解度較低受試物，可使用超聲波裝置助溶或在不破壞受試物的溫度下加熱助溶；非水溶性的受試物，可使用少量對魚低毒的有機溶劑(二甲基亞砜等)助溶后再使用標準稀釋水將其配置成溶液，但有機溶劑在試驗溶液中的濃度不應超過0.1mg／L，并應同時進行兩組對照試驗，一組含有的溶劑為全部試驗溶液中的最高濃度，另一組則不含溶劑或試驗物質的標準稀釋水[3，4]。

1.2.3 斑馬魚急性毒性試驗條件試驗魚缸一般選擇5L容積的玻璃魚缸，使用前應清洗干凈并裝滿純凈水浸泡48h，使用前倒掉魚缸中的純凈水并用標準稀釋水潤洗后裝入4L新配制的標準稀釋水(pH為7.4±0.2，溫度為23±1℃，硬度為250㎎/L左右),曝氣至溶解氧濃度達到空氣飽和值供試驗用，標準稀釋水中溶解氧應不少于4mg/L。實驗時，注意保持魚缸每天光照與黑暗的時間比為16∶8，光照度1000 Lux，魚缸內水溫為23±1℃，pH穩定在7.4±0.2[5]。

1.2.4 受試物劑量選擇和試驗溶液配制根據預實驗，輔酶Q設100、200、400、600、800、1000mg/L共6個劑量組和2個對照組(溶劑對照組和空白對照組)，輔酶Q先用二甲基亞砜助溶后再用標準稀釋水按所設濃度分別配置1L試驗溶液(5倍濃度)供試驗用，溶劑對照組的試驗溶液按二甲基亞砜的最高使用濃度配置，空白對照組的試驗溶液直接使用標準稀釋水。低聚果糖設100、200、400、600、800、1000mg/L共6個劑量組和2個對照組(溶劑對照組和空白對照組)，低聚果糖先用少量蒸餾水溶解后再用標準稀釋水按所設濃度分別配置1L試驗溶液(5倍濃度)供試驗用，溶劑對照組的試驗溶液按蒸餾水的最高使用濃度配置，空白對照組的試驗溶液直接使用標準稀釋水。雙酚A設1、2、4、6、8、10mg/L共6個劑量組和2個對照組(溶劑對照組和空白對照組)，雙酚A先用二甲基亞砜助溶后再用標準稀釋水按所設濃度分別配置1L試驗溶液(5倍濃度)供試驗用，溶劑對照組的試驗溶液按二甲基亞砜的最高使用濃度配置，空白對照組的試驗溶液直接使用標準稀釋水。

1.2.5 斑馬魚急性毒性試驗方法將受試物輔酶Q、低聚果糖、雙酚A配制好試驗溶液(5倍濃度)后，實驗時分別將各劑量組和對照組的試驗溶液加入到已備好的5L魚缸中，并將1L試驗溶液(5倍濃度)和魚缸中的4L標準溶液充分混勻。選擇個體差異不大的健康斑馬魚在每個5L魚缸中投入10條，整個試驗期間不喂食，試驗過程中分別觀察每個魚缸中斑馬魚的反應情況，并記錄有異常反應的斑馬魚的具體反應情況。斑馬魚的中毒反應表現為時而竄動、反應遲鈍、游動能力下降、身體沉底、失去平衡、側翻、身體彎曲、身體畸形、躺臥死亡等，如果斑馬魚沒有任何的生存跡象，如鰓的扇動，碰觸魚后也無反應，即可判斷該魚死亡，發現斑馬魚死亡時要及時撈出死亡個體，并記錄死亡時間。實驗結束后，根據得到的各組死亡情況，統計各組死亡率。采用寇氏法計算受試物對斑馬魚的LC50，計算公式為lgLC50=Xm-i(∑p－0.5)，式中Xm為死亡組最大劑量的對數，i為相鄰兩組劑量對數之差，p為各組某一時間點的死亡率，∑p為各組某一時間點的死亡率之和[5]。受試物對斑馬魚的LC50采用用48hLC50表示結果，并根據“GB/T 21281-2007危險化學品魚類急性毒性分級試驗方法”進行評價。

2 結果

2.1 輔酶Q對斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為100mg/L～1000mg/L的輔酶Q、溶劑對照組和空白對照組的試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應，輔酶Q對斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L。

2.2 低聚果糖對斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為100mg/L～1000mg/L的低聚果糖、溶劑對照組和空白對照組的試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應，低聚果糖對斑馬魚的48hLC50為大于1000mg/L。

2.3 雙酚A對斑馬魚的毒性作用情況斑馬魚在劑量為10mg/L的雙酚A試驗溶液飼養3h后開始出現毒性反應，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗溶液飼養6h后開始出現毒性反應，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗溶液飼養12h后開始出現毒性反應，斑馬魚的毒性反應初期表現為游動能力下降，反應比較遲鈍等中毒癥狀，隨著時間的延長中毒魚出現失去平衡、側翻，并慢慢喪失運動能力，隨后出現身體彎曲、畸形，最后躺臥死亡。斑馬魚在劑量為1mg/L～4mg/L的雙酚A、溶劑對照組和空白對照組的試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應。根據記錄的各組斑馬魚死亡情況，計算各組斑馬魚死亡率，采用寇氏法計算出雙酚A對斑馬魚的48hLC50為7.15mg/L。見圖1。

圖1 雙酚A對斑馬魚的毒性作用情況

3 討論

自20世紀70年代末，國外開始運用斑馬魚進行有毒化學物監測方面的研究，研究的化學物包括鋅、鎘、硒、汞等重金屬以及苯酚、苯胺、環己胺等有機物[6]。近年來，斑馬魚模式動物在國內的江、河水體污染監測和控制等方面的應用逐漸受到研究機構的重視，很多國內研究者開展了激素、中藥、有毒化學品等對斑馬魚毒性影響方面的研究，分析了其在檢測判斷污染物的毒性類型及潛在危害程度方面的特有優勢，這些研究也為斑馬魚模式動物在多領域的拓展應用提供了很好的研究基礎[7-9]。

人們一直以為日常生活環境中接觸的雙酚A濃度很低，不足以構成對人體的危害，在民間、廠商、官方之間一直久拖未決進行著“低劑量雙酚A有害還是安全”的爭論，但在“雙酚A奶瓶事件”發生后，世界各國都對雙酚A的毒性都極其重視，有研究表明[10-13]雙酚A具有一定的毒性和致畸性，可明顯增加動物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥的發生。本研究實驗結果顯示斑馬魚在劑量為10mg/ L的雙酚A試驗溶液飼養3h后開始出現毒性反應，在劑量為8mg/L的雙酚A試驗溶液飼養6h后開始出現毒性反應，在劑量為6mg/L的雙酚A試驗溶液飼養12h后開始出現毒性反應，但斑馬魚在劑量為1mg/L～4mg/L的雙酚A的試驗溶液、溶劑對照組和空白對照組的試驗溶液中飼養48h，未發現斑馬魚有任何毒性反應。本研究結果與相關研究報道有較好的一致性[14，15]。

本研究通過完善和優化試驗用斑馬魚的基本條件、非水溶性和水中溶解度較低的受試物的處理要求和斑馬魚急性毒性試驗條件，使優化的斑馬魚急性毒性檢測方法能夠快速檢測不同類別的食品和食品污染物的急性毒性作用，使該檢測方法有了更廣的應用范圍和更趨于標準化。本研究對推動斑馬魚急性毒性檢測方法的標準化應用提供了研究基礎，對斑馬魚急性毒性檢測方法作為食品安全應急檢測技術的推廣應用提供科學依據，該檢測方法在食品安全性檢測方面將有著廣泛的應用前景。

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Optimization and application on the toxicity test method of zebrafish

LI Zhi，HUANG Junming.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 511430,China

Objective By optimizing the acute toxicity test method of zebrafish,the toxic effect of coenzyme Q,fructooligosaccharides(FOS)and bisphenol A on zebrafish were detected and analyzed,and to explore the application prospect of the method in food safety test and evaluation.Methods The basic state of zebrafish and the acute toxicity test conditions were optimized.Zebrafish were exposured to the solution containing different concentrations of coenzyme Q,FOS and bisphenol A for 48h,the zebrafish toxicity and mortality rate were observed,the toxic effect were detected.Results When zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L coenzyme Q for 48h,no toxicity was found,the LC50of coenzyme Q in 48h was greater than 1000mg/L.While zebrafish were fed in the test solution containing 100～1000mg/L FOS for 48h,no toxicity was found,the LC50of FOS in 48h was greater than 1000mg/L.After zebrafish were fed in the test solution containing 10mg/L bisphenol A for 3h,containing 8mg/L bisphenol A for 6h，containing 6mg/L bisphenol A for 12h，the toxic reaction could be detected,the LC50of bisphenol A in 48h was 7.15mg/L.Conclusion This study showed that the optimized acute toxicity test method of zebrafish can be used as rapid detection method for the acute toxicity of food and food contaminants,and has a wide range of applications in the safety test and evaluation of food.

Zebrafish;Acute toxicity;Bisphenol A;Optimization

R155.5+5

A

1674-1129(2014)06-0658-03

2014-09-02；

2014-10-15)

廣東省醫學科學技術研究基金項目(編號：A2010058)

李志，男,1975年出生,副主任醫師,本科,研究方向∶食品衛生。