應(yīng)用胚胎皮膚細(xì)胞修復(fù)小鼠皮膚缺損的實驗研究

郭相凱韓志華段惠川錢德檢郗林鶴孟飛劉炬王彥

應(yīng)用胚胎皮膚細(xì)胞修復(fù)小鼠皮膚缺損的實驗研究

郭相凱韓志華段惠川錢德檢郗林鶴孟飛劉炬王彥

目的探索胚胎皮膚細(xì)胞修復(fù)小鼠背部皮膚缺損的療效。方法建立小鼠皮膚損傷模型，將小鼠胚胎皮膚的細(xì)胞植入小鼠皮膚損傷處（Nor-T組，n=6），與不作處理的小鼠（Nor組，n=6）進(jìn)行皮膚損傷愈合的比較。分別在術(shù)后第1、2、3周采集標(biāo)本，比較Nor-T組與Nor組創(chuàng)面愈合的情況，以免疫組織化學(xué)方法檢測各組愈合過程中，TGF-β1和TGF-β3因子的表達(dá)情況。結(jié)果術(shù)后第1周，Nor-T組在創(chuàng)傷處形成再生皮膚覆蓋創(chuàng)面；Nor組創(chuàng)面由痂皮覆蓋；術(shù)后第2周，Nor-T組再生皮膚完全形成；Nor組瘢痕愈合。術(shù)后第3周，Nor-T組再生皮膚上生長出黑色毛發(fā)；而Nor組沒有毛發(fā)生長。Nor-T組中，TGF-β1在術(shù)后第1周表達(dá)陽性，TGF-β3在術(shù)后第2周表達(dá)陽性。結(jié)論胚胎皮膚細(xì)胞具有形成再生皮膚和修復(fù)皮膚缺損的能力。

胚胎皮膚細(xì)胞再生皮膚瘢痕形成

瘢痕治療是臨床一大挑戰(zhàn)[1]。不同部位的瘢痕會導(dǎo)致患者肢體功能障礙、運動受限，以及容貌改變導(dǎo)致的心理障礙。研究表明，胚胎皮膚具有強(qiáng)大的再生修復(fù)能力，能夠在受到創(chuàng)傷后重新形成新的皮膚，并具有功能完整的皮膚附件[2-3]。因此，我們擬利用孕17.5 d的小鼠胚胎皮膚細(xì)胞進(jìn)行皮膚缺損修復(fù)的實驗，為無瘢痕愈合研究提供可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國），0.02%中性蛋白酶（Roche公司，德國），0.05%胰蛋白酶（Gibco公司，美國），0.05%Ⅰ型膠原酶（Worthington公司，美國），CM-DIL、兔抗鼠TGF-β1（Abcam公司，美國），TGF-β3（Abcam公司，美國），HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗抗體（博士德公司，武漢），胎牛血清（HYCLONE公司，美國），鏈霉素、青霉素（Gibco公司，美國)。

1.2 實驗動物

8周齡雄性C57小鼠（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司），隨機(jī)分為實驗組和對照組（n=6）。本實驗遵守實驗動物福利倫理原則。

1.3 獲取胚胎皮膚的細(xì)胞

孕17.5 d的C57小鼠脫頸處死后，剖腹取出胚胎（共30只），取胎鼠背部皮膚，剪成1 mm×1 mm大小，PBS浸洗2遍，加入0.02%Dispase，置于4℃冰箱中消化12 h，分離得到表皮和真皮層。將真皮組織剪成肉糜狀后，0.05%Ⅰ型膠原酶重懸，置37℃搖床中消化1 h，然后將細(xì)胞懸液以40 μm單細(xì)胞濾器過濾，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，以含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，待后續(xù)實驗時使用。同時，將分離得到的表皮組織剪成肉糜狀，0.05%胰蛋白酶重懸，置37℃搖床中消化10～15 h，含血清DMEM培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞懸液以40 μm單細(xì)胞濾器過濾，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，dK-SFM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，待后續(xù)實驗時使用。

1.4 胚胎皮膚細(xì)胞的CM-DIL標(biāo)記

將上述兩種細(xì)胞懸液混合（ESkC），使用含20μmol CM-DIL的PBS重懸混合細(xì)胞，在37℃水浴中孵育5 min，然后將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱中低溫孵育30 min，促進(jìn)CM-DIL在細(xì)胞膜上的著色。低溫孵育后PBS清洗2遍，含血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，待回植時使用。

1.5 動物模型的建立

C57小鼠麻醉成功后，使用直徑9 mm的角膜環(huán)鉆在小鼠背部制造一個圓形的全層皮膚缺損。創(chuàng)面曠置的小鼠作為對照組（Nor，n=6），使用ESkC細(xì)胞治療的小鼠作為治療組（Nor-T，n=6）。Nor-T組小鼠在皮膚創(chuàng)傷后使用5-0的尼龍線將硅膠小室固定在創(chuàng)傷處，將8.0×109個ESkC回植入皮膚缺損創(chuàng)面。實驗時，將ESkC懸液在37℃、1 500 r/min條件下離心5 min，去上清液，吸取離心管底部的細(xì)胞回植入硅膠小室內(nèi)，并完全覆蓋皮膚創(chuàng)面（圖1）。Nor組小鼠的創(chuàng)面直接使用凡士林和敷料覆蓋，預(yù)防創(chuàng)面感染。術(shù)后小鼠分籠飼養(yǎng)，常規(guī)抗感染。

1.6 大體觀察

術(shù)后第1、2、3周行大體觀察，比較兩組小鼠創(chuàng)面的修復(fù)情況。

1.7 組織學(xué)觀察

術(shù)后第1、2、3周，在小鼠背部皮膚缺損修復(fù)處取材，所取皮膚包含2 mm寬的正常皮膚邊緣。每個樣本均使用Tissue-Tek OCT包埋、切片。

術(shù)后第1、2周,小鼠背部皮膚組織切片，使用兔抗鼠一抗TGF-β1（1∶200）、TGF-β3（1∶200）在4℃冰箱中低溫孵育過夜。一抗孵育完成后，PBS洗去一抗，使用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗抗體進(jìn)行染色，在室溫中孵育30 min。二抗孵育完成后，PBS洗去二抗，過氧化氫顯色液顯色，鏡下觀察TGF-β因子在組織中的表達(dá)情況。

術(shù)后第2周,小鼠背部皮膚組織切片，經(jīng)染核熒光染料DAPI（1∶1 000，室溫30 sec）染色后，在熒光顯微鏡下觀察被CM-DIL標(biāo)記的細(xì)胞存在情況。

術(shù)后第3周,小鼠背部皮膚組織切片行HE染色，比較兩組皮膚缺損處的愈合情況。

2 結(jié)果

2.1 Nor-T組愈合效果優(yōu)于Nor組

移植術(shù)后第1周，Nor-T組創(chuàng)面已經(jīng)被再生皮膚覆蓋，而Nor組創(chuàng)面由炎性滲出物形成的痂皮覆蓋；術(shù)后第2周，Nor-T組再生皮膚完全形成，Nor組傷口愈合處形成一白色瘢痕；術(shù)后第3周，Nor-T組再生皮膚上生長出黑色毛發(fā)，而Nor組的傷口愈合處仍為瘢痕，沒有毛發(fā)生長（圖2）。HE染色結(jié)果顯示，Nor-T組再生皮膚中有正常的毛囊組織形成，而Nor組沒有毛囊等附件形成（圖3）。上述結(jié)果表明，Nor-T組形成了再生皮膚并修復(fù)了皮膚缺損，而Nor組創(chuàng)面形成瘢痕愈合。

再生皮膚組織切片的熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯3示，標(biāo)記紅色熒光標(biāo)志物CM-DIL的ESkC細(xì)胞出現(xiàn)在再生皮膚中，參與了皮膚組織的再生（圖4）。2.2TGF-β因子在Nor-T組愈合過程中的表達(dá)

術(shù)后第1周，TGF-β1和TGF-β3在兩組中有相似的表達(dá)，TGF-β1陽性表達(dá)，而TGF-β3陰性表達(dá)；術(shù)后第2周，TGF-β1在兩組中均表達(dá)下降，TGF-β3在Nor-T組中局部表達(dá)增加，在Nor組中表達(dá)量少。以上結(jié)果說明胚胎皮膚細(xì)胞表達(dá)TGF-β3，即實驗組中胚胎皮膚細(xì)胞參與了創(chuàng)面的愈合（圖5）。

圖1小鼠治療模型Fig.1The mouse treatment model

圖2各組創(chuàng)面愈合情況Fig.2The observation of the wound healing of each group

圖3術(shù)后第3周各組創(chuàng)面組織學(xué)觀察Fig.3The histological observation of the wounds in each group 3 weeks after operation

圖4 CM-DIL標(biāo)記的ESkC細(xì)胞的觀察Fig.4The observation of ESkC labeled by CM-DIL

圖5 免疫組織化學(xué)檢測各組TGF-β1及TGF-β3在術(shù)后1周、2周的表達(dá)情況Fig.5The expression of TGF-β1 and TGF-β3 in each group by immunohistochemistry 1 and 2 weeks after operation

討論

有文獻(xiàn)報道，胚胎皮膚細(xì)胞可修復(fù)皮膚缺損并構(gòu)建毛囊等皮膚附件[4-5]，提示胚胎皮膚細(xì)胞具有再生能力。因此，我們應(yīng)用小鼠胚胎皮膚細(xì)胞進(jìn)行小鼠皮膚缺損的修復(fù)，觀察其修復(fù)效果。

研究表明，在孕14.5 d時，小鼠胚胎皮膚由未分化的單層上皮細(xì)胞發(fā)育而來[6]；在孕17.5～18.5 d時，信號調(diào)節(jié)毛發(fā)向下生長，形成毛芽，初級毛囊形成[7]。因此，孕17.5～18.5 d的胚胎皮膚細(xì)胞能夠用來構(gòu)建新生皮膚和毛囊。胚胎皮膚可無瘢痕愈合，并正常發(fā)育形成皮膚附件結(jié)構(gòu)。本實驗中，術(shù)后第2周，治療組再生皮膚完全形成，而對照組瘢痕愈合，證實了小鼠胚胎皮膚細(xì)胞具有修復(fù)皮膚缺損的能力。

TGF-β1是創(chuàng)面愈合過程中重要的細(xì)胞因子，在細(xì)胞外基質(zhì)的形成和沉積、細(xì)胞增殖中扮演重要角色。在創(chuàng)面愈合過程中，TGF-β1的表達(dá)參與調(diào)控許多因子，如VEGF、EGF、PDGF和IGF等[8-9]。胚胎期和出生后的創(chuàng)面愈合過程中，產(chǎn)生的TGF-β比例不同。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β3在胚胎無瘢痕愈合過程中形成水平較高，但在成人的皮膚創(chuàng)面中TGF-β1的表達(dá)較高[10]。Ferguson等[11]報道，通過在抗體中加入TGF-β1或TGF-β2，或外源性應(yīng)用TGF-β3能夠促進(jìn)無瘢痕愈合。我們的免疫組化結(jié)果顯示，不同亞型的TGF-β因子在不同傷口愈合時期表達(dá)情況不同。

本實驗中，胚胎皮膚細(xì)胞首先分泌促增殖因子促進(jìn)細(xì)胞增殖；之后分泌促分化的因子誘導(dǎo)細(xì)胞的分化，其中也包括誘導(dǎo)附件的形成。盡管胚胎皮膚細(xì)胞是表皮和真皮細(xì)胞相互混合而成的，但在1周內(nèi)形成了再生皮膚完整正常的皮膚結(jié)構(gòu)和毛囊。

本實驗利用胚胎皮膚細(xì)胞有效修復(fù)了小鼠皮膚創(chuàng)面，再生皮膚覆蓋創(chuàng)面形成新的皮膚屏障。因此，胚胎皮膚細(xì)胞可能為皮膚損傷愈合，尤其是無瘢痕愈合的研究提供了新的思路。

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The Application of Embryonic Skin Cell in Repairing Skin Defect of Mouse

GUO Xiangkai1,2,5,HAN Zhihua3,DUAN

Huichuan3,QIAN Dejian4,XI Linhe5,MENG Fei5,LIU Ju6,WANG Yan5.1 Shangdong Academy of Medical Sciences, Shandong 250062,China;2 School of Medicine and Life Sciences,University of Jinan-Shangdong Academy of Medical Sciences,Shandong 250022,China;3 Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai 200011,China;4 Department of Trauma and Emergency Surgery,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University,Shandong 250014,China;5 Department of Plastic Surgery,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University, Shandong 250014,China;6 Medical Research Center,Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University,Shandong 250014,China.Corresponding author:WANG Yan(E-mail:wangyandr@126.com).

ObjectiveTo explore the efficacy of repairing skin defect of mouse by using embryonic skin cell.Methods Animal model of back skin damage in mice was built.The embryonic skin cells were transplanted into the back skin damage of mice as treatment group(Nor-T group,n=6)and the mice in control group(Nor group,n=6)were received no treatment. The wound healing situation were observed 1,2 and 3 weeks after operation.The expression of TGF-β was detected 1 and 2 weeks after operation.ResultsThe regenerative skin growth was observed on the wound area in Nor-T group,while only crusta was observed on the wound area in Nor group 1 week after operation.The regenerative skin merged with surrounding skin in Nor-T group,while the wound healed with scar in in Nor group 2 weeks after operation.The hair was observed in Nor-T group,while no hair was observed in Nor group 3 weeks after operation.In Nor-T group,TGF-β1 was expressed 1 week after operation and TGF-β3 was expressed 2 week after operation.ConclusionThe embryonic skin cells possess the ability of regenerative skin formation,and TGF-β has different expression at different wound healing phase.

Embryonic skin cell;Regenerative skin;Scar formation

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）02－0073－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.003

2014年1月26日；

2014年3月5日）

山東省科技發(fā)展計劃項目（2011GSF11839）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2009CQ001）。

250062山東省濟(jì)南市山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院（郭相凱）；250022山東省濟(jì)南市濟(jì)南大學(xué)，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（郭相凱）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院（韓志華，段惠川）；250014山東省濟(jì)南市山東省千佛山醫(yī)院創(chuàng)傷急診外科（錢德檢）；250014山東省濟(jì)南市山東省千佛山醫(yī)院整形外科（郗林鶴，孟飛，王彥）；250014山東省濟(jì)南市山東省千佛山醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心（劉炬）。

王彥（E-mail：wangyandr@126.com）。