白樺脂醇的體內抗腫瘤作用及機制

宋添添牟 瑛張桂英

（1解放軍302醫院營養科，北京，100039；2吉林大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，長春，130021）

白樺脂醇的體內抗腫瘤作用及機制

宋添添1牟 瑛1張桂英2

（1解放軍302醫院營養科，北京，100039；2吉林大學公共衛生學院營養與食品衛生教研室，長春，130021）

目的：研究白樺酯醇的體內抗腫瘤作用及機制。方法：采用小鼠肝癌細胞（H22）建立荷瘤小鼠動物模型，白樺脂醇灌胃10 d后，計算抑瘤率、胸腺指數、脾指數；MTT法測定小鼠T淋巴細胞轉化功能及NK細胞殺傷活性。結果：白樺脂醇三個劑量組、陽性對照組瘤重均減輕，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中劑量組抑瘤率最高；三個劑量組脾指數與陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對照組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組胸腺指數與陰性、陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組T淋巴細胞轉化率與陰性對照組和陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組在效靶比為25∶1時，NK細胞殺傷活性高于陽性對照組（P＜0.05），在效靶比為100∶1，殺傷活性高于陰性對照組（P＜0.05）；中劑量組在效靶比為25∶1、50∶1、100∶1時，NK細胞殺傷活性均同時高于陰性對照組和陽性對照組（P＜0.05）；高劑量組在效靶比為25∶1時，NK細胞殺傷活性高于陰性對照組和陽性對照組（P＜0.05）。結論：白樺脂醇通過刺激激活免疫器官，提高T淋巴細胞轉化功能、提高NK細胞殺傷活性來抑制腫瘤細胞增殖。

白樺脂醇；抑瘤效應；MTT；小鼠；免疫細胞

用于治療腫瘤的天然藥物存在選擇性低、毒性大及耐藥等問題。從天然植物中尋找新的抗腫瘤藥物已成為醫學界關注的熱點。白樺脂醇是從樺樹皮中提取的三萜類化合物，具有殺菌、抗病毒、防紫外線、消炎、快速治愈傷口、抗過敏等作用，還可改善受損頭發光澤，促進頭發生長，在食品，醫藥，日用化工等領域有廣泛應用[1－5]，是非常有價值的天然物質，可以從豐富的植物資源中獲得。本研究通過荷瘤小鼠探討白樺酯醇的抗腫瘤的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞株 雄性昆明種小鼠50只，體重（18～20 g），由吉林大學基礎醫學院動物中心提供；小鼠肝癌細胞（H22），由吉林大學公衛學院營養與食品衛生教研室提供，人髓樣白血病細胞（K562），由302醫院艾滋病研究室。

1.2 藥物及主要試劑 白樺脂醇純品從上海升佳公司購得，呈白色粉末狀，含量99%，用橄欖油配成濃度為1 mg·mL－1、2 mg·mL－1、4 mg·mL－1的溶液，4℃保存。用于體內陽性對照的環磷酰胺用生理鹽水配成濃度為2.5 mg·mL－1的溶液，4℃保存。DMSO（北京益利精細化學品有限公司），MTT（AMRESCO公司），小牛血清（FCS，大連生物試劑廠），RPMT－1640、IMDM培養液（GIBCO公司），刀豆凝集素（ConA，美國Sigma公司），IL－2（吉林大學第一醫院）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理 50只雄性昆明種小鼠適應性飼養2 d，取0.2 mL濃度為1×107·mL－1的H22細胞接種至小鼠左下肢腹股溝皮下，4 d后可觸及小米粒大小實體瘤。將小鼠隨機分為5組：陰性對照組（NC）、陽性對照組（PC）、低劑量組（LD）、中劑量組（MD）、高劑量組（HD），每組10只。陰性對照組按0.1 mL·10 g－1體重灌胃橄欖油；陽性對照組按25 mg ·kg－1灌胃環磷酰胺；低劑量組、中劑量組、高劑量組分別按10 mg·kg－1、20 mg·kg－1、40 mg·kg－1灌胃相應濃度的白樺脂醇橄欖油溶液。連續灌胃10 d，第11 d拉頸處死。

1.3.2 白樺脂醇對荷瘤小鼠抑瘤率的影響 小鼠處死后取腫瘤稱重，計算抑瘤率。

1.3.3 白樺脂醇對荷瘤小鼠臟器指數的影響 小鼠處死后無菌條件下取脾、胸腺稱重，計算臟器指數。臟器指數（g/100 g）＝（臟器重/體重）×100。

1.3.4 白樺脂醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞轉化功能的影響 無菌條件下取小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，調細胞濃度至1×107·mL－1，加FCS使血清濃度達10%，取96孔培養板，每只小鼠設：1）對照孔，每孔加入100 μL IMDM培養液；2）ConA刺激孔，每孔加入10μg· mL－1ConA液100μL，各3復孔，然后每孔加入100μL小鼠脾細胞懸液。將培養板移入CO2孵箱孵育44 h，各孔加入MTT溶液10μL，繼續孵育4 h后終止培養，吸棄孔內上清，每孔加入DMSO 100μL，震蕩10 min。酶標儀570 nm波長處測定各孔OD值。

1.3.5 白樺脂醇對荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響 靶細胞制備需用1640培養液調K562細胞濃度至2×105·mL－1，加入FCS使血清濃度達10%；效應細胞制備需取淋轉所用濃度為1×107·mL－1的脾細胞懸液，用10%FCS－IMDM調至5×106·mL－1和2.5× 106·mL－1；取靶細胞懸液50μL和效應細胞懸液100 μL加入96孔培養板，效靶比分別為100∶1、50∶1、25∶1，空白對照組加靶細胞懸液50μL和完全培養液100μL，效應細胞對照組加相應濃度的脾細胞懸液200 μL；每個樣品3復孔。將培養板移入CO2孵箱孵育20 h，每孔吸出上清液100μL，補充無血清1640培養液100μL，MTT 20μL，繼續培養4 h終止培養，每孔吸出上清120μL，加入DMSO 150μL，震蕩，酶標儀570 nm波長處測定各孔OD值。

A：靶細胞加效應細胞混合培養孔OD值；B：效應細胞對照孔OD值；C：空白對照孔OD值

2 結果

2.1 白樺脂醇對荷瘤小鼠抑瘤率的影響 白樺脂醇三個劑量組小鼠瘤重均減輕，與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中中劑量組抑瘤率最高。見表1。

表1 白樺脂醇對荷瘤小鼠抑瘤率的影響（g，±s）

表1 白樺脂醇對荷瘤小鼠抑瘤率的影響（g，±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05。

組別例數瘤重抑制率（%）52.03 NC 10 1.14±0.28－LD 10 0.69±0.21*39.60 MD 10 0.56±0.15*51.31 HD 10 0.73±0.20*36.04 PC 10 0.55±0.17*

2.2 白樺脂醇對荷瘤小鼠脾指數、胸腺指數的影響白樺脂醇各劑量組與陰性、陽性對照組比較，脾指數均升高，與陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對照組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組與陰性、陽性對照組比較，胸腺指數升高且差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 白樺脂醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞轉化功能的影響 白樺脂醇低、中劑量組與陰性對照組比較，T淋巴細胞轉化率有所上升，陽性對照組與陰性對照組比較，T淋巴細胞轉化率有所下降，中劑量組與陰性對照組和陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表2 白樺脂醇對荷瘤小鼠脾指數、胸腺指數的影響（g/100 g，±s）

表2 白樺脂醇對荷瘤小鼠脾指數、胸腺指數的影響（g/100 g，±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

Group 例數脾指數胸腺指數NC 10 0.66±0.15 0.13±0.02 LD 10 0.75±0.20△0.15±0.02 MD 10 0.85±0.17*△0.18±0.05*△HD 10 0.94±0.20*△0.16±0.09 PC 10 0.54±0.13 0.13±0.04

表3 白樺脂醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞轉化功能的影響（±s）

表3 白樺脂醇對荷瘤小鼠T淋巴細胞轉化功能的影響（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

組別例數SI NC 10 1.15±0.19 LD 10 1.25±0.10 MD 10 1.52±0.21*△HD 10 1.14±0.08 PC 10 1.04±0.09

2.4 白樺脂醇對荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響

當效靶比為25∶1時，白樺脂醇三個劑量組小鼠NK細胞殺傷活性均高于陰性對照組和陽性對照組，低劑量組與陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中、高劑量組與陰性對照組和陽性對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；效靶比為50∶1時，中劑量組NK細胞殺傷活性最高，為32.4%，與陰性對照組和陽性對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）；效靶比為100∶1時，低、中劑量組NK細胞殺傷活性與陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），中劑量組與陽性對照組比較差異亦有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 白樺脂醇對荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響（±s）

表4 白樺脂醇對荷瘤小鼠NK細胞殺傷活性的影響（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與PC組比較，△P＜0.05。

組別例數NK細胞殺傷活性（%）25∶1 50∶1 100∶1 NC 10 19.0±1.9 17.8±1.6 17.9±1.3 LD 10 22.1±2.6△21.7±2.5 23.2±2.7*MD 10 29.9±1.4*△32.4±3.0*△26.3±2.5*△HD 10 24.9±2.4*△17.0±2.3 18.7±3.1 PC 10 17.3±1.7 17.7±2.7 19.2±1.4

3 討論

三萜類化合物中的白樺脂酸有抗炎、抗腫瘤，抗人類免疫缺陷病毒（HIV）等作用[6－13]，可由白樺脂醇經兩步反應得到[14－16]。蔡唯佳等[17]研究發現白樺脂醇對體外培養的食管癌細胞有抑制作用。本研究結果表明，白樺脂醇各劑量組與陰性對照組比較，瘤重均減輕（P＜0.05），特別是中劑量組，抑瘤率達51.31%，接近陽性對照組的抑瘤率，說明白樺脂醇可較好地抑制腫瘤生長。

有研究認為，白樺脂酸能夠提高T細胞增殖力，增強NK細胞活性，提高INF水平，抑瘤機制可能與直接或間接增強機體抗腫瘤免疫有關[18－19]。脾指數、胸腺指數的增大反映了脾、胸腺重量的增加，因此用脾指數和胸腺指數評價白樺脂醇對荷瘤小鼠免疫器官的影響。本研究結果表明，中劑量組白樺脂醇的脾指數、胸腺指數同時高于陽性對照組和陰性對照組（P＜0.05），低劑量組脾指數高于陽性對照組（P＜0.05）；高劑量組脾指數高于陰性對照組和陽性對照組（P＜0.05），陽性對照組脾指數較陰性對照組低。說明白樺脂醇對小鼠免疫器官有一定的刺激激活作用，其中中劑量組作用最強。T淋巴細胞是重要的免疫活性細胞，主要發揮細胞免疫作用，并協助B淋巴細胞產生抗體，釋放淋巴因子參與免疫調節，在抗感染、抗腫瘤、免疫監視方面發揮重要作用。在特異性或非特異性抗原如ConA、PHA等的誘導下，T淋巴細胞可發生轉化、增殖，故T淋巴細胞轉化功能反映了機體的免疫狀況[20－21]。本研究結果表明：低、中劑量組與陰性對照組比較，T淋巴細胞轉化率有所上升，陽性對照組與陰性對照組比較，T淋巴細胞轉化率下降，中劑量組與陰性對照組和陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），說明中劑量白樺脂醇可以促進T淋巴細胞轉化，增強機體的免疫功能。NK細胞主要發揮免疫監視和抗腫瘤作用[20－21]，能夠調節B淋巴細胞、胸腺細胞、骨髓干細胞的分化并分泌IL－1、IL－2、INF－α和INF－γ等。NK細胞殺傷活性可反應機體的免疫功能。本研究結果表明，低劑量組在效靶比為25∶1時，NK細胞殺傷活性高于陽性對照組（P＜0.05），在效靶比為100∶1，殺傷活性高于陰性對照組（P＜0.05）；中劑量組在效靶比為25∶1、50∶1、100∶1時，NK細胞殺傷活性同時高于陰性對照組和陽性對照組（P＜0.05）；高劑量組在效靶比為25∶1時，NK細胞殺傷活性高于陰性對照組和陽性對照組（P＜0.05）。說明白樺脂醇可以提高NK細胞殺傷活性，增強機體非特異性免疫功能，中劑量組作用最強，在效靶比為25∶1時，殺傷活性最高。而白樺脂醇提高機體非特異性免疫功能是如何在分子水平上發揮作用的，有待進一步研究。

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（2013－12－11收稿 責任編輯：曹柏）

Anti-tumor Effects of Betulin and Its M echanism in Vivo

Song Tiantian1，Mu Ying1，Zhang Guiying2
（1 Department of Nutrition，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China；2 Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective：To investigate the anti-tumor activity of betulin in vivo and it'smechanism.Methods：The study built tumor bearingmicemodel by injecting H22 tumor cells on themice＇s left inguinal region.Themicewere given intragastric administration of betulin for ten days.Inhibition ratio，thymus index and spleen index were calculated after that.Then betulin＇s effects on T lymphocyte transformation，NK activity were detected using MTTmethod.Results：Tumorweight of three betulin groups and positive control group decreased compared with that of negative control group（P＜0.05），especially that of themiddle dose group.Spleen index in betulin group had significant difference compared with positive control group（P＜0.05）.Middle dose and high dose group had significant difference from negative control group（P＜0.05）.Thymous index in middle dose group had significant difference compared with negative control and positive controlgroup（P＜0.05）.Tlymphocyte transformation rate ofm iddle dose group had significant difference compared with negative control and positive control group（P＜0.05）.When effect cell/target cell was 25，NK activity in low dose group was higher than positive control group（P＜0.05），and when effect cell/target cellwas100，itwas higher than negative control group（P＜0.05）；NK activity inmiddle dose group was higher than negative control and positive control group，when effect cell/target cellwas 25 or 50 or 100（P＜0.05）；NK activity in high dose group was higher than negative control and positive control group when effect cell/target cell was25.Conclusion：Betulin can inhibit the proliferation of tumor cell by promoting T lymphocyte transformation and enhancing NK activity.

Betulin；Anti-tumor；MTT；Mice；Immune cells

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673－7202.2014.07.025

吉林省科技廳資助項目（編號：201105020）

宋添添（1985—），碩士，醫師，本文為作者在讀碩士期間所做部分研究

張桂英（1957—），女，本科，高級實驗師，研究方向：營養與疾病控制，E－mail：943769970＠qq.com