大黃素對大鼠糖尿病視網膜病變發展的影響

李明存，劉遠光，張 滌，王冬蘭

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科，黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見和嚴重的微血管并發癥之一。隨著糖尿病患病率的逐年增高以及患病人群年齡有開始向低的趨勢，DR已成為致盲的主要原因之一，這在很大程度上對患者、家庭和社會均造成極大的危害和負擔。目前已有多種藥物和制劑被用于防治DR的發生和進展，但由于DR的發病機制尚未有確切結論，盡管某些藥物臨床前實驗和臨床研究已取得了令人鼓舞的結果，但尚無一種藥物能有效控制DR的發展，因此尋找并篩選防治DR的藥物受到國內外醫學界的高度重視。有實驗研究表明大黃素對血管平滑肌細胞的增殖有抑制作用[1]，且對高糖條件下的視網膜血管內皮細胞的增殖的抑制與有很多相似性[2]，因此從這一點出發，我們推測大黃素可能對DR的增殖趨勢也具有抑制作用。本研究通過復制糖尿病大鼠模型，給予大黃素后，觀察大鼠視網膜中FN和CD105表達情況的變化，研究大黃素對糖尿病視網膜病變的影響，以期為臨床治療提供佐證和指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組

健康Wistar大鼠78只，體重180～200g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物一般情況良好，皮毛光澤，進食與活動正常，自然光線條件下適應性喂養7d后，隨機分為3組：正常對照組、DR組、DR+大黃素組。

1.1.2 試劑與儀器

大黃素購自西安飛達生物技術有限公司；STZ(Sigma 公司)由上海寶曼生物技術有限公司提供；兔抗大鼠FN、CD105單克隆抗體由武漢博士得生物工程有限公司提供；ONETOUCHSelectSimple穩擇易血糖儀及其配套試紙由美國強生(中國)醫療器材有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立與處理

正常組大鼠始終給予常規飼養條件，不做特殊處理。適應性喂養一周后將DR組和DR+大黃素組大鼠給予高脂高糖飲食6周，禁食24h，腹腔注射STZ 30mg·kg-1，72h后連續3d尾靜脈取血，用強生穩擇易血糖儀檢測血糖含量在16.7以上者為造模成功，作為糖尿病實驗對象。實驗期間大鼠繼續輔以高脂高糖飲食，每周觀測血糖，每天監測體質量。實驗結束時，去除中間死亡鼠及血糖恢復鼠，每組以25只作為實驗統計樣本。治療組于造模成功后4周開始按照0.3g/kg·d經胃給藥，DR組給予相同劑量的溫水。

1.2.2 取材

各組大鼠以STZ注射造模成功后開始算起，分別于第6、8、10、12、14周以多聚甲醛心臟灌注處死5只大鼠，取出完整眼球，置于4 %多聚甲醛溶液固定并石蠟包埋，以行免疫組化檢測。

1.2.3 免疫組化

取大鼠眼球，經固定，石蠟包埋，切片，烤片制成組織芯片，脫蠟、梯度酒精至水，PBS沖洗，枸櫞酸鹽酸緩沖液微波加熱抗原修復，3%H2O2溶液阻斷內源性過氧化酶，PBS沖洗，山羊血清封閉，一抗孵育4℃過夜，PBS沖洗，二抗孵育30min，PBS沖洗，DAB顯色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，實驗數據以均數±標準差(即)表示，采用單因素方差分析法，各組間比較采用LSD檢驗和Dunnet’s T3檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FN在各個時期的表達

見表1。

2.2 CD105在各個時期的表達

見表2。

表1 FN在大鼠視網膜中各時期的表達

*vs空白組P<0.05，**vs空白組P<0.01，△vs對照組P<0.05，△△vs對照組P<0.01。

表2 CD105在大鼠視網膜中各時期的表達

vs空白組P<0.01，vs對照組P<0.01。

3 討論

糖尿病性視網膜病變(DR)是一個多因素的復雜疾病過程。我國糖尿病患者中糖尿病性視網膜病變的患病率達44%～51.3%[4]。在組織學上，糖尿病性視網膜病變的改變主要是毛細血管功能和結構的異常改變，血管的通透性改變，出現微血管瘤和新生血管等；在分子水平上，則是促進新生血管因子與抑制因子之間的平衡被打破。當糖尿病視網膜病變發展到一定階段時, 視網膜組織隨著缺血缺氧的加重, 視網膜毛細血管內皮細胞產生一系列因子促使新生血管生成新生血管的形成,包括毛細血管基底膜的降解、內皮細胞的遷移增殖以及管腔的形成[3]。本研究擬從糖尿病大鼠模型以及糖尿病視網膜病理改變入手，利用鏈脈佐菌素(STZ)腹腔注射，配合高脂高糖飲食建立糖尿病大鼠模型，觀察大黃素對大鼠視網膜病理形態學改變以及對視網膜免疫組化處理后FN和CD105表達的改變。纖維連接蛋白(fibronectin，FN)是一種大分子多功能的細胞外基質糖蛋白，可由內皮細胞、上皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞等多種細胞產生，廣泛存在于細胞表面、細胞外液、結締組織及大部分基底膜。在其它疾病的研究中發現，細胞外基質成分中的纖維黏連蛋白在增進細胞的黏附，促進細胞的遷移及分化，參與細胞骨架構建及細胞形態的形成中有著活躍的功能。CD105具有特殊的組織學標記，在內皮細胞顯著表達，并能選擇內皮細胞，在人類微血管內皮細胞和增生的血管內皮細胞中，CD105已被檢測出大量表達于細小的和尚未成熟的血管中，尤其在再生組織和炎癥組織中。本實驗表明，在糖尿病大鼠視網膜組織中，FN與CD105的表達均高于正常大鼠，且與疾病進展成正向的相關性，在應用大黃素進行藥物治療后，FN的表達結果較未治療組明顯著下降，而CD105的表達則呈顯著下降。因此大黃素對DR有一定的治療作用，可能通過其抗炎作用而抑制新生血管及纖維組織的增生，這為DR的治療提供了一個新的視角。

[1]王翔飛，葛均波，孫愛軍，等．大黃素通過p53途徑抑制血管平滑肌細胞增殖的實驗研究[J].中華心血管病雜志，2006，34(1)：44

[2]劉光輝．大黃素對高糖條件下VEGF 表達及人視網膜血管內皮細胞增殖的影響[D].衡陽：南華大學，2012

[3]王虹, 吉雷, 劉遠光，等.結締組織生長因子與糖尿病并發的眼部缺血缺氧性疾病[J].黑龍江醫藥科學，2011，36(6)：72

[4]崔翠,齊艷秀,宿星杰，等.糖尿病性視網膜病變的病因與治療的研究進展[J].黑龍江醫藥科學，2011，34(3)：68