腎茶對UUO大鼠腎組織FaS、FasL表達的影響

王麗敏，田玉鳳，譚振香，郭佳麗，Amrita Shrestha(尼泊爾)，王 超

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科，黑龍江 佳木斯 154003)

腎茶作為傳統民間藥物已流傳使用了幾百年，民間常用來治療急慢性腎炎、泌尿系統結石、膀胱炎、痛風、動脈硬化、黃疸、咽炎，風濕性關節炎等疾病。毒性小，使用安全。本實驗旨在研究腎茶對UUO大鼠腎小管上皮細胞Fas、FasL表達的影響,揭示腎茶在腎間質纖維化形成中保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

72只清潔級SD大鼠，雄性，體重(100±5)g,購自長春實驗動物中心。隨機分為假手術組、模型組、腎茶組3組,每組24只，模型組、腎茶組分別行左側輸尿管結扎、離斷,假手術組只將左側輸尿管分離,不結扎、離斷。腎茶組給予劑量為8g/kg的腎茶煎劑灌胃，模型組、假手術組則給予等體積0.9%生理鹽水代替灌胃。

1.2 建立UUO模型

按照董飛俠，何立群等人報道的方法進行[1]。采用10%水合氯醛(0.35mL/100g計算)將大鼠麻醉,待麻醉起效后將大鼠固定為左側俯臥位, 在其左側肋脊角下方約0.5cm的皮膚處縱行切開,將其皮下組織及肌層鈍性分離,暴露左側腎臟,分離其左輸尿管,并于中上1/3處結扎,離斷，使左腎梗阻,逐層縫合完畢后，背部皮下注射5萬U青霉素鈉。假手術組大鼠暴露左腎后只分離輸尿管,不結扎。

1.3 實驗方法

購置大鼠后,放置在清潔級飼養房并適應性喂養1周,造模成功后, 分別于術后3d、7d、14d各組分別隨機選取8只大鼠，麻醉后心臟取血，用來測定血尿素氮、血肌酐，處死大鼠并摘取其左側腎臟,左腎組織采用免疫組化法檢測蛋白Fas和FasL。

1.4 試劑及檢測

免疫組化試劑盒購自天津所羅門生物制品公司，其中一抗Fas、FasL為兔抗大鼠蛋白抗體。經DAB顯色后，將含有黃色顆粒的腎實質及間質細胞視為陽性,免疫組化的結果采用多功能彩色計算圖像分析系統進行半定量分析，每例分別隨機選取5個高倍視野,計算每個視野內染色區域的面密度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件，三組均數間比較用隨機區組方差分析；兩組均數間差別用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 大鼠血肌酐,尿素氮測定

造模后3d,7d,14d模型組及腎茶組大鼠血Scr、BUN升高，與假手術組相比，各組間比較差異具有統計學意義(P<0.05);其中模型組上升明顯,同假手術組相比,差異有統計學意義(P<0.05);腎茶組與模型組相比各時間點Scr、BUN下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠各時間點血Scr、BUN的變化

注：*與假手術組比較P<0.05;▲與模型組比較P<0.05。

2.2 免疫組化法檢測Fas和FasL

2.2.1 Fas及FasL的表達

Fas、FasL主要表達于近端腎小管上皮細胞, 其中皮髓質交界處表達強，而在遠端腎小管、系膜細胞、炎癥細胞等表達極少。見圖1。

2.2.2 Fas、FasL 面密度半定量分析

假手術組大鼠術側(左側)腎各時間點Fas、FasL表達均較弱；同假手術組相比，模型組自造模后3d后腎小管上皮細胞Fas、FasL表達愈發增強，各時間點差異均具有統計學意義(P<0.05);同模型組相比，腎茶組造模后各時間點Fas、FasL表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖2 術后各組大鼠FasL的表達(10×40)

表2 各組大鼠各時間點Fas、FasL 面密度半定量分析

注：*與假手術組比較P<0.05;▲與模型組比較P<0.05。

3 討論

各種原因所致慢性腎臟病進展的共同途徑是不可逆的腎臟間質纖維化，這一不可逆的腎損害最終導致腎高血壓乃至腎衰竭,而腎臟細胞凋亡在這一病理生理形成的過程中起到了重要的作用[2]。李彪等[3]研究結果顯示腎間質纖維化的發展與腎小管上皮細胞的過度凋亡密切相關,而高表達的Fas/FasL導致腎小管上皮細胞凋亡,這一機制最終使腎小管上皮細胞數目減少,臨床表現為腎功能下降，這說明Fas系統介導了腎小管上皮細胞的凋亡[4]。UUO模型是結扎單側輸尿管以造成腎功能損傷、間質纖維化、腎小管細胞凋亡及炎癥細胞浸潤為特征的經典模型,也是目前應用最廣泛的腎間質纖維化模型[5]，顯著改善UUO模型的腎臟損傷可以通過調控腎小管細胞凋亡而實現[6]。 膜FasL、抗Fas-特殊的抗體和塊狀可溶的FasL的刺激可引起誘導的含有Fas蛋白的細胞發生凋亡[7]。多種腎臟疾病的發生、發展及修復過程與細胞凋亡有關，而這一過程受多種因素調控[8]，在眾多凋亡調控因素中Fas/FasL最具代表性，因其可直接參與啟動細胞凋亡[9]。有研究用DNA 斷裂的原位末端標記法測得急性腎衰竭時腎小動脈、腎小管及周圍區域的細胞凋亡數目增加，腎功能的下降與凋亡小體的不斷增加相一致;同時免疫組化結果顯示，在UUO腎組織的近曲小管遠曲小管周圍Fas/FasL表達明顯增加，這一結果提示Fas/FasL途徑參與了腎小管上皮細胞凋亡的發生，而本研究也有相似的發現。

本實驗采用經典的UUO(腎間質纖維化)模型，研究梗阻性腎病時腎茶干預與否的腎小管上皮細胞Fas、FasL的表達的變化，研究結論提示正常的腎臟組織在各時間點Fas、FasL表達少量，當發生腎纖維化時其表達量明顯增強，隨著造模時間的延長Fas、FasL表達量逐漸增加，這與仙淑麗等人的[10]研究一致。Fas、FasL表達的這種變化可能因為腎發生梗阻時，腎固有細胞凋亡大于細胞增殖，從而導致增殖與凋亡關系的失衡，引起臨床上一系列病理生理變化。 腎茶(C.Spicatus)是一種多年生草本植物，唇形科貓須草屬(Clerodendranthus)，又稱貓須草、牙路妙、貓須公,此藥為印度尼西亞草藥，當地醫生常用治結石病，效果頗著。該藥從印尼至南亞諸島及澳洲均有生長，近年來有應用單味腎茶及其復方制劑治療尿路感染,腎病綜合征[11]、腎衰竭[12]等臨床報道。

本研究結果表明，單味腎茶對UUO大鼠腎功能及腎纖維化的發展具有保護作用，其機制之一可能是通過調節Fas/FasL系統，降低Fas、FasL蛋白的表達水平，從而抑制腎小管細胞的凋亡。然而，Fas/FasL系統只是凋亡發生過程中眾多傳導途徑中的其中之一，其抑制凋亡的機制是否還與其他信號傳導途徑有關，另外，臨床上腎茶若與西藥結合治療腎纖維化是否效果更好，均尚待進一步探索研究。

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