左乙拉西坦對致癇大鼠海馬組織中BMP4表達的影響

王一川，穆國軍,王 影

(佳木斯大學附屬第一醫院兒內二科，黑龍江 佳木斯 154003)

癲癇(epilepsy,EP)是一種慢性疾患，是兒童神經系統疾病中的常見病，其特點是大腦神經元反復發作性異常放電，可突然、陣發、反復發作的一組臨床綜合征。癲癇的發病率與年齡有一定的關系，嬰幼兒時期是患病率最高的，反復的癲癇發作嚴重影響患兒的健康和生活質量[1]。有研究表明，早發性癲癇，可能會導致智力能力和特定的認知功能受損，如意識、運動功能等[2]。目前，國內治療癲癇的方法，主要依賴于長期的藥物治療。左乙拉西坦是一種新型抗癲癇藥物，與其他的抗癲癇藥作用機制較復雜，有研究資料表明：癲癇可導致海馬組織中的BMP4表達，但左乙拉西坦對海馬組織中的BMP4表達的影響國內外尚無研究報道，本課題將對此進一步探索。

1 材料與方法

1.1 動物分組

將116只Wistar大鼠隨機分為：鹽水組(NS組)24只、左乙拉西坦對照組(LEV對照組)24只、模型組(PILO組)34只、模型組+左乙拉西坦組(LEV治療組)34只。

1.2 主要的實驗試劑

氯化鋰，匹羅卡品 ( Sigma公司 )，左乙拉西坦( UCB S.A.Belgim 公司 ) , RT PCR 試劑盒、引物合成(北京華邁科生物技術有限公司)。

1.3 模型制作

參照相關文獻[3]的模型制作，具體操作步驟如下:按順序測量每只大鼠體重，隨機分組標記并記錄，取PILO組和LEV治療組，先將氯化鋰溶于滅菌注射用水(10mg/mL)，按125mg/kg對大鼠進行腹腔注射,16h后，以1mg/kg的硫酸阿托品對大鼠腹腔注射，拮抗外周膽堿能反應，30min后，腹腔注射匹羅卡品60mg/kg，觀察大鼠的情況，影像學記錄，如果沒有出現大鼠癲癇持續狀態，應每隔30min重復腹腔注射匹羅卡品1次, 再次應用匹羅卡品劑量減小至15mg/kg，直至出現Ⅲ級以上癲癇持續發作,始終不出現Ⅲ級以上癲癇發作的大鼠不應納入本實驗，但如果大鼠癲癇發作持續15min以上，立即予以10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以終止癲癇發作。對NS對照組和LEV對照組，每次對大鼠進行腹腔注射等量生理鹽水。大鼠癲癇發作的評分標準采用國際Racine分級：即0級:無驚厥發作;Ⅰ級:耳面部抽搐;Ⅱ級:耳面部抽搐+節律點頭,但無直立位;Ⅲ級:肌陣攣,伴前肢站立;Ⅳ級:全身強直陣攣發作;Ⅴ級:全身強直陣攣發作+失去體位控制。LEV對照組和LEV治療組，將左乙拉西坦片溶解于滅菌注射用水中(10mg/mL)，對大鼠灌胃，劑量為200mg/kg；對NS組、PILO組，予等量生理鹽水進行灌胃，均每天一次，連續灌胃3周。

1.4 采集標本與測定

組織切片與取材，提取海馬組織。分別于模型制作的第1、2、3周，乙醚罐中放入大鼠，吸入高濃度乙醚達到麻醉狀態時，斷頭活殺，迅速剪開大鼠的顱骨以取出海馬組織，存入實驗室-70℃冰箱內保存，待所有樣本集全，做提取mRNA準備。

1.5 RT-PCR測定BMP4的表達

將海馬組織加入Trizol液提取總mRNA,進行逆轉錄合成cDNA。將cDNA產物進行RT-PCR循環。設計BMP4和GAPDH實驗引物序列，引物由天津意源達生物試劑有限公司合成，PAGE純化。β-actin為內參，β-actin上游引物：5’-CATCCGTAAA GACCTCTATGCCAAC- 3’，下游引物：5’-ATGGAGCCACCGATCCACA- 3’，擴增長度171bp;BMP4上游引物：5'-TGGACACCTCATCACACGACTA-3，BMP4下游引5'-GCGA- CGGCAGTTCTTATTCTTC-3' ，擴增長度352bp。進行PCR反應后，開始瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像軟件測定BMP4的表達。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 記錄觀察各組大鼠行為學變化

PILO模型組和LEV治療組，在匹羅卡品腹腔注射的約5～10min，大鼠就出現癲癇發作，表現為點頭、洗臉、瞳孔縮小、血淚、豎毛、流涎、排泄、跌倒、前肢陣攣、翻滾以至全面性強直陣攣發作，均出現Ⅲ級以上癲癇持續發作。在大鼠癲癇持續發作超過15min后，給予10%的水合氯醛3mL/kg腹腔注射，以終止癲癇發作。其后，LEV治療組每日一次給予LEV200mg/kg灌胃治療，LEV治療組大鼠比PILO組癲癇發作及程持續時間及程度明顯減少。LEV對照組與NS對照組無抽搐發作。

2.2 各組大鼠海馬組織中BMP4表達

表1所示各組海馬組織中BMP4-mRNA的相對表達量的比較:與NS對照組相比，各時間點的PILO模型組和LEV治療組海馬組織中BMP4-mRNA的表達水平明顯升高,尤以1w升高非常顯著(P<0.01)，以后逐漸降低，但仍高于NS對照組。各時間點LEV治療組與PILO模型組相比較，LEV治療組的BMP4-mRNA表達水平顯著低于PILO模型組(P<0.01)。各時間點LEV組與NS組比較，無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 各組大鼠海馬組織中BMP4-mRNA的相對表達量的比較

注：*與NS組比較：P>0.05；★與NS對照組比較：P<0.01；#與NS對照組比較：P<0.01；※與PILO模型組：P<0.01。

圖1 RT-PCR檢測各組大鼠BMP4的表達

3 討論

癲癇是兒童時期常見的神經系統疾病之一，在嬰兒及兒童時期發病率較高,2歲之前發生率約占癲癇患者總數的40%[4]。海馬是大腦神經發育的最重要腦區之一，無論在胚胎時期乃至成年，海馬對于短暫記憶以及學習習慣起著基本的作用[5]。很多學者研究發現，海馬做為在大腦中發作閾值低的部位，是幾乎所有癲癇患者發作的起始區，而且，以海馬區為主的癲癇發作，長期反復發作，大多很難用藥物控制[6]。研究證實，長期反復的癇性發作，可使人類神經元損傷和神經膠質細胞增生[7]。

BMP是一種多功能的生長因子，屬于轉化生長因子(TGF-β)超家族成員。BMP信號通過絲氨酸或蘇氨酸激酶受體調節、分化，促進和培養的神經元的生長，對調節和平衡神經膠質細胞和神經元的發育，發揮重要作用[8]。研究發現，BMP與神經元損傷和神經膠質細胞電位有著密切的關系[9]。其中，BMP 4信號被報道對星形膠質細胞系增殖是必不可少的[10]。馬玉新[11]等人通過用戊四氮建立癲癇大鼠模型研究發現，在模型建立的5d后BMP4免疫反應樣陽性細胞顯著增多并達到高峰，以后表達逐漸下降，90d后仍高于正常對照組。有研究發現，正常組大鼠海馬有少量BMP4表達。在癲癇發作的3d后BMP4 mRNA表達明顯增高，達到高峰，此后表達水平逐漸下降[12]。 左乙拉西坦是一種新型的第二代廣譜抗癲癇藥，具有易溶解和生物利用率高的化合物，不良反應少，口服幾乎完全吸收。目前關于左乙拉西坦對BMP4表達尚無研究報道，本實驗研究結果顯示，左乙拉西坦可以抑制癲癇海馬組織中BMP4的表達，從而抑制癲癇發作。

綜上所述，左乙拉西坦可能是通過抑制海馬組織中BMP4的表達上調，提高驚厥發作閾值，抑制星形膠質細胞系增殖，從而降低癲癇的敏感性而發揮其抗癲癇作用。本文的研究為進一步明確海馬組織中BMP4表達上調及神經元可塑性在癲癇形成中發揮的重要作用提供了理論依據，更為癲癇的臨床治療提供了新的思路。

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