鱉源凡隆氣單胞菌分離株對稚鱉的致病力

孫 波，江玲麗

（1.國家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316021）

鱉源凡隆氣單胞菌分離株對稚鱉的致病力

孫 波1，江玲麗2

（1.國家海洋局第二海洋研究所，浙江杭州 310012；2.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316021）

從發病中華鱉分離得到2株細菌，經Vitek生化反應鑒定為凡隆氣單胞菌（Aeromonasυeronii）。通過稚鱉致病力試驗與毒力基因分析評估細菌的毒力風險，結果表明，2株凡隆氣單胞菌分離株均對稚鱉具有較強的毒力，在24～48 h達到死亡高峰，半數致死量（LD50）分別為6.17與6.05；其肝臟細菌增殖曲線與死亡變化相符，于24～48 h達到峰值（105g-1）。分離株的毒力基因型為aerA+act+alt+ast-。

中華鱉；凡隆氣單胞菌；致病力；毒力基因

中華鱉（Trionyχsinens）隸屬爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，具有很高的營養和藥用價值，是我國淡水養殖的名優產品。中華鱉在我國分布廣泛，除新疆、西藏和青海外，其他各省均有生產。浙江省作為我國中華鱉養殖的主產區，2012年養鱉產量逾15萬t，產值約70億元，約占全國50%［1-2］。

隨著養殖規模的擴大與集約化程度的提高，中華鱉病害發生率不斷上升，且常呈現暴發流行，給養殖戶帶來嚴重的經濟損失，影響了中華鱉養殖業的健康持續發展。先前的研究顯示，細菌性病原是引起中華鱉發病最重要的微生物性因素之一［3-7］。氣單胞菌屬（Aeromonas）細菌是引起中華鱉暴發性死亡的主要病原，也是中華鱉細菌性疾病中引起經濟損失最為嚴重的致病菌［2，6-7］。其中致病性氣單胞菌主要包括嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）與凡隆氣單胞菌（A.υeronii）［2，8］。這兩種氣單胞菌均為人獸魚共患病原菌，對人類健康與公共衛生存在較大的隱患。鱉源嗜水氣單胞菌的致病力研究相對較多，已證實其對稚鱉具有較高的致病力［9-10］；而凡隆氣單胞菌對稚鱉的致病力研究則鮮見報道。因此，本研究針對2株采自浙江省發病中華鱉的凡隆氣單胞菌分離株，進行種別鑒定，并通過稚鱉攻毒試驗與毒力基因分析評估其毒力風險，旨在為中華鱉氣單胞菌病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細菌鑒定

兩株凡隆氣單胞菌分別分離自2批次發生大規模死亡的中華鱉瀕死個體，分別命名為B1與B2。分離株接種于腦心浸液培養基（BHⅠ，青島海博生物技術有限公司），28℃振蕩培養。經革蘭氏染色，在油鏡下判定其為革蘭氏陽性或陰性；據此選擇相應的生化測定卡，應用全自動微生物分析儀（Vitek 2 Compact，Biomerieux，France）測定細菌的46個生化指標，與數據庫信息進行比對以確定菌種。

1.2 細菌對稚鱉致病力測定

1.2.1 細菌半數致死量

將270只（12±2）g的健康稚鱉隨機分為9組，每組30只，適應性飼養5 d后備用。飼養用水為經48 h自然曝氣的自來水，水溫控制在28℃，pH值7.1，水質符合NY 5051-2001無公害食品淡水養殖用水水質要求。

分離株B1與B2接種于BHⅠ培養基，28℃培養18 h，用無菌生理鹽水（0.85%NaCl）將菌液倍比稀釋成106，107，108，109m L-1的梯度菌懸液，對8組稚鱉進行菌液腹腔注射，注射部位為后肢近上方的腹面空腔，每只注射0.1 m L，折合實際注射濃度為105，106，107，108只-1；同時對陰性對照組（CK）稚鱉注射等體積的無菌生理鹽水。連續觀察7 d，記錄其死亡情況；同時對瀕死中華鱉的肝、腎進行細菌分離和鑒定。根據修正的斯皮爾曼-卡伯分析方法，計算各菌株半數致死量（LD50）［11］。

1.2.2 肝臟細菌含量

將90只（12±2）g的健康稚鱉隨機分為3組，每組30只，適應性飼養5 d后備用。飼養用水同1.2.1節所述。分別腹腔注射實際濃度106只-1的B1與B2菌液至1組稚鱉，同時以等體積的無菌生理鹽水注射陰性對照組稚鱉。分別于注射后4，24，48，72，96，120 h，每組每次剖取3只稚鱉，對肝臟細菌進行細菌計數。

1.3 毒力基因測定

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取細菌基因組DNA，保存于-20℃備用。應用PCR技術測定氣單胞菌4個主要毒力基因，包括氣溶素（aerA）與3種重要腸毒素，即細胞毒性腸毒素（act）、不耐熱細胞緊張性腸毒素（alt）、耐熱細胞緊張性腸毒素（ast）［12］（表1）。為驗證PCR產物是否為特異性擴增，每個基因均隨機選取20%的擴增片段進行測序、比對。

PCR反應采用25μL反應體系：10×Taq Buffer（含Mg2+）3μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 0.6μL，50μmol·L-1上下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，Taq DNA polymerase 0.3μL，加雙蒸水補足體積。反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸時間按1 000 bp· min-1計算，30個循環；72℃5 min。目的基因、引物序列及退火溫度參見表1。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經Goldview染料染色后用凝膠成像系統分析。產物回收純化后送至上海英駿生物技術有限公司測序。

表1 引物序列與擴增長度

2 結果與分析

2.1 細菌鑒定

分離株B1與B2的菌落微白、光滑、半透明。經革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陰性菌。基于Vitek測定的46個生化反應結果，B1與B2均為凡隆氣單胞菌，置信度達99%。

2.2 細菌對稚鱉的致病力

凡隆氣單胞菌分離株B1與B2對稚鱉呈現相似的致死規律：108組在注射后4 h出現死亡，在24 h達死亡高峰，并在48 h內全部死亡；107組亦在注射后4 h出現死亡，在24～48 h出現死亡高峰，并在72 h內全部死亡；106組在注射后28 h出現死亡，并在24～96 h持續死亡，累積死亡個體占攻毒個體的50%～70%；105組僅有1只稚鱉死亡（表2）。剖檢死亡個體的肝、腎，均分離得到與原注射菌菌落形態一致的細菌，并經Vitek判定為凡隆氣單胞菌。基于修正的斯皮爾曼-卡伯分析方法，B1與B2的半數致死量（LD50）分別為6.17與6.05（表2）。

與上述死亡變化相符，106組稚鱉的肝臟細菌含量在24～48 h達到高峰（達105g-1），之后持續下降（圖1）。綜上所述，分離株B1與B2均對稚鱉具有較強的致病力。

圖1 攻毒后稚鱉肝臟細菌含量測定

2.3 細菌毒力基因

分離得到的2株凡隆氣單胞菌株均含有aerA，act，alt基因，而缺失ast（表3）。與其他4組已報道的鱉源氣單胞菌比較，安徽與江蘇分離株的aerA陽性率分別為83%與75%，其余3組則均為陽性；本研究與廣西分離株的act陽性率均為100%；但廣西分離株的alt陽性率為77%，而本研究與安徽分離株則均為100%；本研究的ast陽性率為0，其余4組鱉源氣單胞菌則未檢測該基因。由此可見，鱉源氣單胞菌的aerA，act，alt陽性率較高；本研究分離株B1與B2的毒力基因型為aerA+act+alt+ast-，其aerA與alt陽性率高于其他組的平均水平。

表2 凡隆氣單胞菌分離株B1與B2對稚鱉的毒力測定

表3 鱉源氣單胞菌毒力基因型比較

3 小結

本研究從兩批次浙江瀕死中華鱉中分離得到2株凡隆氣單胞菌B1與B2，所分離到的B1與B2菌株對稚鱉具有較強的毒力，其毒力基因型為aerA+act+alt+ast-。強致病性的凡隆氣單胞菌對水生動物健康與水產品質量安全造成極大的隱患，亟需建立針對致病性氣單胞菌的監測體系，以期為病害防控提供科學依據，保障中華鱉產業健康持續發展。

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（責任編輯：高 峻）

S 96

A

0528-9017（2014）06-0936-03

文獻著錄格式：孫波，江玲麗.鱉源凡隆氣單胞菌分離株對稚鱉的致病力［J］.浙江農業科學，2014（6）：936-939.

2014-02-19

浙江省科技計劃項目（2008C33049）

孫 波（1976-），男，浙江杭州人，研究方向為生物工程及水處理開發。E-mail：ppgsunbo@163.com。

江玲麗。E-mail：allan_523@163.com。