補腎通督膠囊對RA患者Th17/Treg平衡影響的研究

朱陽春王英旭林 琳侯麗萍

（1北京中醫(yī)藥大學，北京，100029；2太原市類風濕病醫(yī)院，山西，030060）

臨床研究

補腎通督膠囊對RA患者Th17/Treg平衡影響的研究

朱陽春1王英旭2林 琳1侯麗萍1

（1北京中醫(yī)藥大學，北京，100029；2太原市類風濕病醫(yī)院，山西，030060）

目的：觀察補腎通督膠囊對腎虛寒凝型類風濕性關節(jié)炎患者外周血Th17/Treg細胞及血清白細胞介素17A（IL-17A）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-10的影響。方法：入選類風濕性關節(jié)炎患者隨機雙盲分為治療組（36例）和對照組（35例），治療組口服補腎通督膠囊，對照組口服雷公藤多苷片，均服藥12周，采用流式細胞術觀察比較治療前后兩組患者外周血Th17/Treg及采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）觀察血清IL-17A、TGF-β1、IL-10的變化。結(jié)果：治療后兩組與各自治療前相比，Th17及Th17/Treg顯著降低（P＜0.01），Treg顯著升高（P＜0.01）；治療后兩組間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后兩組與各自組治療前相比，IL-17A顯著降低（P＜0.01），TGF-β1、IL-10顯著升高（P＜0.01）；治療后兩組間比較，治療組TGF-β1與IL-10升高更加明顯（P＜0.01），IL-17A無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：補腎通督膠囊可以明顯降低腎虛寒凝型類風濕性關節(jié)炎患者外周血Th17/Treg水平，降低血清IL-17A含量，而使血清TGF-β1、IL-10含量升高。

補腎通督膠囊；類風濕性關節(jié)炎；Th17/Treg；IL-17A；TGF-β1；IL-10

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種慢性、進行性、系統(tǒng)性自身免疫病，以對稱性的外周關節(jié)持續(xù)性滑膜炎為主要特征，我國初步調(diào)查該病發(fā)病率約為0.32%～0.36%[1]。RA的發(fā)病機制尚未全完清晰，其癥狀與病情的進展與免疫失衡密切相關，主要表現(xiàn)為Th1/Th2比例失衡。隨著對RA發(fā)病機制的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg免疫失衡導致了持續(xù)的局部關節(jié)炎癥，造成對骨及軟骨的侵襲破壞，最后導致關節(jié)強直、畸形、功能喪失[2]。輔助性T細胞17（T help cell 17，Th17）主要功能為介導炎癥反應，通過釋放白細胞介素17（IL-17）、白介素22（IL-22）等細胞因子，吸引炎性趨化因子和致炎因子聚集在正常細胞周圍[3]，IL-17還可以與其他致炎信號分子協(xié)同作用，增強致炎效應[4]。調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory Tcell，Treg）是一類特意性表達叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白3（Forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3），包括天然的T調(diào)節(jié)細胞和可誘導的T調(diào)節(jié)細胞。天然Treg的抑制機制主要是細胞接觸依賴性及細胞因子非依賴性，而獲得性Treg的抑制機制不依賴于細胞間接觸而是依賴細胞因子的作用[5]，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、IL-10等途徑發(fā)揮抑炎和維持自身免疫耐受的作用[6]。CD4+CD25+Treg屬于天然調(diào)節(jié)T細胞，而Tr1和Th3屬于獲得性調(diào)節(jié)性T細胞[7]。與正常人相比，RA患者外周血CD4+T細胞中，Th17比率上升，而Foxp3+CD+CD25+Treg細胞比率降低，Th17/Treg細胞免疫失衡，向Th17方向偏移[8]。本文從分子水平出發(fā)，探討了補腎通督膠囊對中醫(yī)辨證屬腎虛寒凝型的RA患者外周血Th17/Treg細胞及分泌的細胞因子的影響。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2012年11月至2013年9月太原類風濕病醫(yī)院符合納入標準的RA患者。根據(jù)隨機數(shù)表，按1∶1比例隨機雙盲分為補腎通督膠囊治療組和雷公藤多苷片對照組，共收入患者74例，脫落3例，最終完成71例。治療組36例，男性8例，女性28例；年齡28～65歲，平均（54.08±8.25）歲；病程18～335個月，平均（106.00±83.44）個月。對照組35例，男性8例，女性27例；年齡24～63歲，平均（51.23±9.83）歲；病程24～300個月，平均（119.47±88.43）個月。兩組性別、年齡、病程經(jīng)統(tǒng)計學處理，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 診斷標準 西醫(yī)診斷標準參照美國風濕病學會及歐洲抗風濕聯(lián)盟2010年共同制定的《類風濕性關節(jié)炎診斷及治療指南》[9]，中醫(yī)診斷及辨證分型標準參照2008年中華中醫(yī)藥學會《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南·中醫(yī)病證部分》[10]及參照1994年國家中醫(yī)藥管理局《中醫(yī)病證診斷療效標準》[11]中尪痹的腎虛寒凝型。

1.3 納入標準 年齡在18～65周歲之間，符合美國風濕病學會及歐洲抗風濕聯(lián)盟2010年RA診斷標準，X線分期處于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，中醫(yī)辨證為腎虛寒凝型。

1.4 排除標準 1）目前正在參加或在本研究前1個月內(nèi)參加過其他治療RA臨床研究。2）近期準備生育，或處于孕期或哺乳期女性。3）長期服用糖皮質(zhì)激素治療RA，且在本研究前至少1個月內(nèi)未停用藥物。4）合并有心血管、肺部、肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)等嚴重疾病。5）重疊其他風濕病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、嚴重的膝骨關節(jié)炎等。6）合并嚴重關節(jié)外表現(xiàn)如高熱不退、間質(zhì)性肺炎、腎臟淀粉樣變、縮窄性心包炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎等，需要使用糖皮質(zhì)激素治療。7）伴有活動性胃腸道疾病，或本項研究前30 d內(nèi)有食物或消化道潰瘍。

1.5 脫落標準 1）患者依從性差，中途停止治療者；2）發(fā)生嚴重并發(fā)癥，研究無法繼續(xù)者；3）病情嚴重惡化，必須采用其他治療者；4）受試者不能堅持治療者。

2 方法

2.1 治療方法 治療組口服補腎通督膠囊（太原市類風濕病醫(yī)院院內(nèi)制劑，藥物組成：熟地黃、鹿角、肉桂、芥子、制馬錢子、麻黃），3次/d，3粒/次，飯后溫水送服；對照組口服雷公藤多苷片，3次/d，1片/次，飯后溫水送服。兩組療程均為12周。

2.2 檢測方法 兩組患者在用藥前及用藥12周后，于清晨空腹抽取外周血15 mL，其中10 mL加入肝素鈉抗凝管中，使用淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞后，置于1 640培養(yǎng)液、胎牛血清和刺激劑中培養(yǎng)4 h，平均分成2份，分別按試劑盒說明書步驟進行破膜和固定，一份過程中加入PerCP-Cy5.5-CD4抗體、PE-IL-17A抗體；另一份過程中加入FITC-CD4抗體、APC-CD25抗體、PE-FoxP3抗體。之后分別使用BD FACSCalibur流式細胞儀檢測其熒光反應，采用BD Cell Quest軟件分析測定Th17/Treg的比值；另5 m L加入2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，離心后收集血清，-80℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-17A、TGF-β1、IL-10含量。

2.3 主要試劑及實驗儀器 BD FACSCalibur流式細胞儀（BD，美國）；酶標儀DENLEY DRAGON Wellscan MK 2（Thermo，芬蘭）使用Ascent software for Multiskan軟件進行分析；洗板機為Wellwash 4 MK2（Thermo，芬蘭）。

牛的II型膠原（Sigma，美國）；人淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）；PerCPCy5.5-CD4抗體（BD，美國）；PE-IL-17A抗體（BD，美國）；FITC-CD4抗體（BD，美國）；APC-CD25抗體（BD，美國）；PE-FoxP3抗體（BD，美國）；IL-17A、TGF-β1、IL-10酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（山西普興生化有限公司）。

2.4 統(tǒng)計方法 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有結(jié)果均以（±s）表示，采用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 流式細胞術檢測外周血Th17/Treg 治療后兩組與各自治療前相比，Th17及Th17/Treg顯著降低（P＜0.01），Treg顯著升高（P＜0.01）；治療后兩組間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 兩組治療前后Th17/Treg細胞在CD4+T細胞中的表達情況（±s）

表1 兩組治療前后Th17/Treg細胞在CD4+T細胞中的表達情況（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別例數(shù)例時間Th17（CD4+ IL-17A+，%）Treg（CD4+CD25 +FoxP3+，%）Th17/Treg治療組36治療前3.74±1.521.21±1.605.13±2.68治療后2.07±1.76**4.47±2.81**0.89±0.99**對照組35治療前3.81±1.801.16±1.595.40±3.83治療后2.49±2.00**3.68±2.86**1.38±2.25**

圖1 兩組治療前后Th17/Treg在CD4+T細胞中的表達情況

圖2 治療組Th17/Treg的典型圖例

3.2 ELISA檢測血清IL-17A、TGF-β1、IL-10 治療后兩組與各自組治療前相比，IL-17A顯著降低（P＜0.01），TGF-β1、IL-10顯著升高（P＜0.01）；治療后兩組間比較，治療組TGF-β1與IL-10升高更加明顯（P＜0.01），IL-17A無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組治療前后血清IL-17A、TGF-β1、IL-10含量（±s）

表2 兩組治療前后血清IL-17A、TGF-β1、IL-10含量（±s）

注：與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別例數(shù)時間IL-17A（pg/mL）TGF-β1（pg/mL）IL-10（pg/mL）治療組36治療前34.78±3.8117.94±1.2417.15±2.51治療后20.14±3.80**28.15±4.70**△△24.69±4.00**△△對照組35治療前34.94±2.9618.35±1.1217.62±4.05治療后21.61±2.71**25.15±2.21**21.49±2.47**

4 討論

RA是一種以慢性的自身免疫性疾病，其主要病理改變?yōu)殛P節(jié)滑膜的慢性炎性反應，造成骨、軟骨及關節(jié)周圍組織的破壞。RA發(fā)病率居自身免疫性疾病的首位[12]，未經(jīng)治療的RA患者2年致殘率達50%，3年致殘率達70%，大約有一半的RA患者最終因致殘喪失勞動能力[13]。

現(xiàn)代醫(yī)學對RA的發(fā)病機制尚未明確，一般認為是感染引起的遺傳易感個體的自身免疫反應。Th17細胞亞群是介導自身免疫性疾病的中藥群體。Th17細胞分化并且產(chǎn)生的IL-17是一種強大的前炎性細胞因子，可以誘導RA患者核因子κB受體活化因子配體（RANKL）表達，誘導破骨細胞祖細胞向成熟破骨細胞分化，使破骨增加而成骨減少，造成對關節(jié)骨與軟骨的侵蝕破壞[14]；還可以產(chǎn)生IL-17F/IL-17A蛋白異二聚體，從而促使T細胞介導的免疫應答[15]。可誘導的T調(diào)節(jié)細胞一種在TGF-β1的誘導下，分化為表達Foxp3的Treg，另一種不表達Foxp3，形成以IL-10高表達為標志的Treg細胞[16]。IL-10能夠抑制促炎性細胞因子如TNF-α、IL-6、IFN-γ的生成，可以明顯延緩滑膜炎性反應的進展[17]。TGF-β1在低濃度時與IL-6協(xié)同作用，促進Th17的分化[18]；在高濃度狀態(tài)下上調(diào)Foxp3的表達，促進Treg細胞的產(chǎn)生，抑制炎性反應形成并防止自身免疫性疾病的產(chǎn)生[19]。有研究表明，在RA發(fā)病時，血液中的TGF-β1可以游離至組織中，使血液中TGF-β1降低[20]。可見Th17細胞和Treg細胞在分化上具有相互排斥的信號通路，在功能上相互抑制，Th17/Treg細胞比率的平衡對維持正常免疫應答及防止自身免疫具有重要意義。

補腎通督膠囊是由陽和湯化裁而來，主要成分為熟地黃、鹿角膠、肉桂、芥子、制馬錢子、麻黃等。全方辛散滋補同伍，通中有補，扶正與祛邪兼顧，以達到補腎通督、化瘀散結(jié)消腫的作用。從藥理學方面分析，本方具有較好的消炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)和改善骨破壞的作用。方中熟地黃可以提高免疫器官的增長指數(shù)，增強巨噬細胞的吞噬能力[21]；鹿角膠可以顯著增加成骨細胞數(shù)量，降低骨轉(zhuǎn)化，提高骨質(zhì)量[22]；馬錢子具有顯著的鎮(zhèn)痛消炎作用，還可以對免疫功能進行雙向調(diào)節(jié)[23]。前期的研究顯示補腎通督膠囊對于中醫(yī)辨證屬于腎虛寒凝型的RA有著確切的臨床療效[24]。腎虛寒凝型RA為臨床常見證型，主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛腫脹，晨僵，活動不利，畏寒怕冷，神倦懶動，腰背酸痛，俯仰不利，天氣寒冷加重，舌淡胖，苔白滑，脈沉細。

本研究表明，補腎通督膠囊可以明顯降低RA患者外周血Th17細胞比率（P＜0.01），而使Treg細胞升高（P＜0.01），使Th17/Treg向Treg方向偏移，糾正RA患者的免疫偏移。在Th17/Treg的調(diào)節(jié)上，與對照組雷公藤多苷片相比較，沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在細胞因子調(diào)節(jié)方面，可以使血清中的IL-17A濃度顯著降低，而TGF-β和IL-10顯著升高（P＜0.01）；與對照組相比，使TGF-β和IL-10升高的作用要明顯優(yōu)于雷公藤多苷片（P＜0.01），而IL-17A的調(diào)節(jié)沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究的對照組藥物雷公藤多苷片是緩解RA病情的有效藥物，其主要成分為雷公藤甲素，具有抗炎、免疫抑制、糖皮質(zhì)激素樣作用作用[25]，可以改善RA患者的病情。但是雷公藤多苷片的有效成分，也是它的毒性成分，容易發(fā)生不良反應。2012年4月國家藥品不良反應監(jiān)測中心公布了2004年至2011年9月雷公藤片不良反應病例報告201例，其中嚴重者19例（9.5%），主要表現(xiàn)為藥物性肝炎、肝腎功能異常、腎衰竭、胃出血、白細胞減少、血小板減少、閉經(jīng)等[26]。雷公藤多苷片，對于RA病情的控制療效確切，但不宜耐受且不能長期應用，在應用上有明顯的局限性。

以Th17/Treg為靶點研究RA越來越受到人們的關注，但目前此類研究大多圍繞動物模型展開。而本項研究表明，補腎通督膠囊在調(diào)節(jié)Th17/Treg方面與雷公藤多苷片沒有統(tǒng)計學意義，對于個別相關細胞因子的作用甚至更有優(yōu)勢，而且安全性更高，在治療腎虛寒凝型RA上有一定的優(yōu)勢，有著更廣闊的開發(fā)空間，是中醫(yī)藥在治療RA方面的重要應用，但其作用機制與有效靶點有待于進一步深入研究。

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（2013-11-27收稿 責任編輯：曹柏）

Study on Effect of Bushen Tongdu capsule on Peripheral Th17/Treg Ratio of Patients with Rheumatoid A rthritis

Zhu Yangchun1，Wang Yingxu2，Lin Lin1，Hou Liping1
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Taiyuan city class rheumatism hospital，Shanxi030060，China）

Objective：To investigate the effectof Bushen Tongdu capsule on peripheral Th17/Treg ratio and serum IL-17A，TGF-β1 and IL-10 of patients with rheumatoid arthritis（RA）.Methods：RA patients were divided randomly and double-blinded into treatment group（n＝36）that were treated with Bushen Tongdu capsules and control group（n＝35）that were treated with Tripterygium glycosides tablets.Patients in both groups were treated for12 weeks.The changes of peripheral blood Th17/Treg ratio and serum IL-17A，TGF-β1 and IL-10 were observed by flow cytometry and ELISA in patients of both teams before and after the treatments.Results：After treatments，Peripheral Th 17%，Th17/Treg ratio significantly decreased and Treg%significantly evaluated（P＜0.01）in both groups，and there was no statistically significant difference between the two groups after the treatments（P＞0.05）.After treatments，the level of serum IL-17A significantly decreased，and TGF-β1 and IL-10 significantly evaluated in both groups（P＜0.01）.Comparing the two groups，TGF-β1 and IL-10 evaluated more in treatment group（P＜0.01），while there was no statistically significant difference between the two groups on the changes of IL-17A（P＞0.05）.Conclusion：Bushen Tongdu capsule can reduce RA patients｀peripheral Th17/Treg ratio and serum IL-17A content，and it also can evaluate serum TGF-β1 and IL-10 content.

Bushen Tongdu capsule；Rheumatoid arthritis；Th17/Treg；IL-17A；TGF-β1；IL-10

R255.9；R259

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.013

山西省科技攻關項目（編號：20120313025-8）

侯麗萍，Tel：13681214238，E-mail：houli＿ping＠163.com