HPLC一測多評法用于木香及3種含木香中藥復方制劑的質量評價Δ

楊 憲，劉筱琴，張 雪，楊水平，余曉東，和七一，趙 瑛（.重慶師范大學生命科學學院，重慶033；.重慶化工職業學院應用化學系，重慶 0000；3.重慶市中藥研究院，重慶 00065；.西南大學資源環境學院，重慶 0076）

HPLC一測多評法用于木香及3種含木香中藥復方制劑的質量評價Δ

楊 憲1＊，劉筱琴2，張 雪3#，楊水平4，余曉東1，和七一1，趙 瑛1（1.重慶師范大學生命科學學院，重慶401331；2.重慶化工職業學院應用化學系，重慶 400020；3.重慶市中藥研究院，重慶 400065；4.西南大學資源環境學院，重慶 400716）

目的：建立測定木香及3種含木香的中藥復方制劑中木香烴內酯和去氫木香內酯含量的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）一測多評法，選取木香烴內酯作為內參物，建立該成分與去氫木香內酯的相對校正因子（f），從而對木香及3種含木香的中藥復方制劑中的木香烴內酯和去氫木香內酯進行含量測定。結果：木香烴內酯和去氫木香內酯的進樣量分別在0.101 2～3.036 0μg（r＝0.999 8）和0.101 8～3.084 0μg（r＝0.999 9）范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系；f＝1.077 7，用木香烴內酯加f測得去氫木香內酯的加樣回收率為99.53%，RSD＝1.11%（n＝9）。結論：該試驗首次采用HPLC一測多評法測定了木香和3種含木香的中藥復方制劑中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量，方法準確、可行。

一測多評法；校正因子；木香烴內酯；去氫木香內酯；木香；中藥復方制劑；含量測定

＊高級工程師，博士。研究方向：中藥新藥及保健食品開發。E-mail：yyxdsp@163.com

#通信作者：副研究員，碩士。研究方向：藥用植物栽培技術。E-mail：zhangxue0012003@163.com

木香及3種含木香的中藥復方，包括六味木香散（由木香、梔子、鬧羊花等6味中藥組成）、麻仁潤腸丸[由火麻仁、苦杏仁（去皮炒）、大黃、木香等6味中藥組成）、五味麝香丸[由麝香、訶子（去核）、黑草烏、木香、藏菖蒲5味藥材組成]，在2010年版《中國藥典》（一部）中均有收載。上述3種復方均具有行氣導滯、瀉熱通便之功效，適用于濕熱內停、赤白痢疾、大便不通等證，廣泛用于治療各種腸胃疾病[1-4]，因而全國有數百家制藥廠均在生產，是市場流通量較大的中成藥之一。但是，目前對這些復方的質量控制較弱，導致了在產品質量方面的一些問題。鑒于此，本研究首次運用“一測多評”的思路，以木香烴內酯加校正因子，采用高效液相色譜（HPLC）法對木香及3種含木香的中藥復方同時測定其中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量，并對該方法在中藥質量控制中的可靠性進行了驗證。

1 “一測多評”的原理

“一測多評”的原理如下：在線性范圍內某成分的質量或者濃度與檢測器響應成正比，即：W＝fA，在多指標質量評價時，以某藥材中有對照品供應的一典型成分為內參物，建立該成分與其他成分之間的相對校正因子（f），進而通過f計算其他成分的含量。這種通過測定其中一個成分，實現對多個成分定量的方法稱為“一測多評”[3-5]。

假設某樣品中含有i個成分，則：

式中，Wi為成分濃度；Ai為成分峰面積。選取其中之一的成分k為內參物，建立成分k與其他成分m之間的f，則：

式（2）中，Ak為內參物峰面積；Wk為內參物濃度；Am為其他成分m的峰面積；Wm為其他成分m的濃度。

2材料

2.1 儀器

LC-2010A型HPLC儀（日本島津公司）、2690-2487型HPLC儀（美國Waters公司）、1200型HPLC儀（美國Agilent公司），均包括脫氣機、自動進樣器、柱溫箱；AE163型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-1000型超聲波處理器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2.2 藥品與試劑

六味木香散、麻仁潤腸丸、五味麝香丸（購自重慶桐君閣大藥房，批號分別為20120801、130201、130102）；木香烴內酯、去氫木香內酯對照品（國家標準物質標準樣品信息中心，批號分別為553-21-9、477-43-0，化學結構式見圖1）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

圖1 木香烴內酯和去氫木香內酯的化學結構式A.木香烴內酯；B.去氫木香內酯Fig 1 Chem ical structures of costunolide and dehydrocostus lactoneA.costunolide；B.dehydrocostus lactone

2.3 藥材

木香藥材分別于不同時間采自重慶開縣、云南麗江、陜西西安、湖北利川、湖南益陽、廣東廣州、廣西南寧、四川雅安，均經重慶中藥研究院張雪副研究員鑒定為真品。

3 方法與結果

3.1 色譜條件與系統適用性試驗

參照2010年版《中國藥典》（一部）木香項下色譜條件[2]：流動相為甲醇-水（65∶35，V/V），流速為1.0 m l/min，柱溫為30Ⅱ，進樣量為10μl，檢測波長為225 nm。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯色譜峰的峰形尖銳、對稱性好；供試品中木香烴內酯和去氫木香內酯的色譜峰對稱性好，與前后其他峰的分離度均＞1.5，達到了基線分離。色譜見圖2。

3.2 溶液的制備

3.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒質量的木香烴內酯和去氫木香內酯對照品適量，加甲醇制成每1m l含木香烴內酯0.506mg、去氫木香內酯0.514mg的溶液，作為兩種單一成分的對照品貯備液。精密吸取兩種對照品貯備液各2m l，置于同一10m l量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。

圖2 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.木香藥材；1.木香烴內酯；2.去氫木香內酯Fig 2 HPLC chromatogram sA.m ixed control；B.Aucklandia lappa samples；1.Costunolide；2.Dehydrocostus lactone；

3.2.2 木香藥材溶液的制備 取木香粉末（過四號篩）約0.30 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，搖勻，稱定質量，放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30min，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

3.2.3 各中藥復方溶液的制備 （1）六味木香散供試品溶液：取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，稱定質量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。（2）麻仁潤腸丸供試品溶液：取本品研細的細粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50m l，密塞，稱定質量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30m in后取出，放冷后再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。（3）五味麝香丸供試品溶液：取粉碎后的本品1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氯仿25m l，密塞，稱定質量并放置過夜，超聲處理（功率：250W，頻率：50 kHz）30min后取出，放冷后再稱定質量，用氯仿補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5m l，置蒸發皿中揮干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5m l量瓶中，即得。

3.3 f的測定方法

取木香烴內酯和去氫木香內酯對照品溶液各適量，按“3.1”項下色譜條件用自動進樣器分別進樣30、20、10、5、2、1 μl，按公式（1），以木香烴內酯為內參物，計算去氫木香內酯的f值。

3.4 f測定方法的耐用性研究

3.4.1 儀器的檢測波長λ對f的影響 HPLC儀紫外檢測器的λ存在偏差，且λ示值誤差為±2 nm，因此筆者分別在229、227、225、223、221 nm波長處測定并計算去氫木香內酯的f，考察λ的變化對f的影響，詳見表1。

表1 儀器λ的變化對f的影響Tab 1 Effectsof the changesof detection wavelength on correction factor（f）

表1結果表明，在同一臺HPLC儀上，λ在已確定波長處變化為±2 nm或±4 nm，對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，RSD＝0.79%（n＝5）。

3.4.2 儀器流速對f的影響 HPLC儀的流速也可能有偏差，在使用同一臺HPLC儀時，檢定誤差應為±2%，因此筆者分別在流速為0.98、1.00、1.02m l/min時測定并計算去氫木香內酯的f，考察流速變化0.02m l/m in對f的影響。進一步擴大試驗，計算0.80、1.20m l/min流速下去氫木香內酯的f，考察流速變化對f的影響，詳見表2。

表2 儀器流速變化對f的影響Tab 2 Effects of the changes of flow rate on correction factor（f）

表2結果表明，在同一臺HPLC儀上，流速變化對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，RSD＝1.05%（n＝5）。

3.4.3 HPLC柱溫對f的影響 HPLC儀的柱溫箱也是有偏差的。《藥品檢驗儀器檢定規程》中規定環境溫度在10～30Ⅱ內，8 h內的溫度波動為±3Ⅱ，HPLC儀柱溫箱的誤差是±0.1Ⅱ，因此筆者采用同一臺HPLC儀，分別在33.0、30.1、30.0、29.9、27.0Ⅱ測定并計算去氫木香內酯的f，考察HPLC柱溫變化對f的影響，詳見表3。

表3 HPLC柱溫變化對f的影響Tab 3 Effects of the changes of colum n tem perature on correction factor（f）

表3結果表明，在同一臺HPLC儀上，柱溫變化對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，RSD＝0.39%（n＝5）。

3.4.4 流動相比例對f的影響 HPLC儀的流動相比例也會對對照品的f造成影響，因此筆者使用同一臺HPLC儀，選擇流動相甲醇-水的比例分別為55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25（V/V）時測定并計算去氫木香內酯的f，考察流動相比例對f的影響，詳見表4。

表4 流動相比例對f的影響Tab 4 Effects of the composition proportion of mobile phaseon correction factor（f）

表4結果表明，在同一臺HPLC儀上，流動相比例變化對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，RSD＝1.04%（n＝5）。

3.4.5 同規格不同品牌HPLC柱對f的影響 HPLC儀在定量測定時會使用不同品牌的液相色譜柱，筆者采用同一臺HPLC儀，使用5支同規格不同品牌的液相色譜柱（C18，250mm×4.6 mm，5μm）測定并計算去氫木香內酯的f，考察同規格不同品牌的HPLC柱對f的影響，詳見表5。

表5 同規格不同品牌的HPLC柱對f的影響Tab 5 Effects of chromatographic columnsw ith same specification from differentbrandson correction factor（f）

表5結果表明，在同一臺HPLC儀上更換液相色譜柱，對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，RSD＝0.83%（n＝5）。

3.4.6 不同HPLC儀對f的影響 筆者采用島津ODS液相色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），分別在3臺HPLC儀上測定并計算去氫木香內酯的f，考察不同HPLC儀對f的影響，詳見表6。

表6 不同HPLC儀對f的影響Tab 6 Effects of different HPLC instrument on correction factor（f）

表6結果表明，HPLC儀的變化對木香烴內酯計算所得去氫木香內酯的f影響不大，SD＝0.94%（n＝3）。

根據“3.4.1”至“3.4.6”項下所得值計算平均值：f＝（1.079 0+ 1.074 3+1.079 3+1.077 0+1.075 3+1.081 3）/6＝1.077 7。

3.5 方法學考察

3.5.1 線性關系考察 按“3.2.1”項下方法制備對照品去氫木香內酯和替代對照品木香烴內酯溶液，在“3.1”項下色譜條件下，按“3.4”項下f測定方法進行測定。結果表明，木香烴內酯、去氫木香內酯進樣量分別在0.101 2～3.036 0、0.101 8～3.084 0 μg范圍內與各自峰面積積分值呈良好線性關系。二者的回歸方程分別為y＝1×106x+4 496.4（r＝0.999 8，n＝6）、y＝1× 106x－8 791.8（r＝0.999 9，n＝6）。

3.5.2 精密度試驗 取“3.2.1”項下混合對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下重復進樣6次，測定峰面積。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為0.76%和1.25%（n均為6），表明儀器精密度良好。

3.5.3 重復性試驗 取同一批木香藥材粉末適量，按“3.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“3.1”項下色譜條件下進樣測定。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為0.84%和1.13%（n均為6）。取同一批六味木香散樣品適量，按“3.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“3.1”項下色譜條件下進樣測定。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為0.97%和1.21%（n均為6）。表明本方法重復性良好。

3.5.4 穩定性試驗 取同一批木香藥材供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”項下色譜條件下進樣測定。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為0.93%和 0.81%（n均為6），表明木香藥材供試品溶液在16 h內穩定性良好。取同一批六味木香散的供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、16 h在“3.1”項下色譜條件下進樣測定。結果顯示，木香烴內酯和去氫木香內酯的RSD分別為0.76%和1.04%（n均為6），表明六味木香散的供試品溶液在16 h內穩定性良好。

3.5.5 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批木香藥材樣品（重慶開縣產，木香烴內酯含量：18.36mg/g，去氫木香內酯含量：25.81mg/g）9份，各約0.15 g，精密稱定，分別置于50m l錐形瓶中，每3份為一組，分別按80%、100%和120%的加入量精密加入木香烴內酯和去氫木香內酯對照品溶液，照“3.2.2”項下方法制備供試品溶液。按擬定方法，各精密吸取10μl注入HPLC儀，在“3.1”項下色譜條件下測定，計算加樣回收率，結果分別見表7、表8。再采用木香烴內酯加f的方法對去氫木香內酯進行含量測定，計算加樣回收率，結果見表9。

表7 木香烴內酯的加樣回收率（n＝9）Tab 7 Recovery ratesof costunolide（n＝9）

表8 用去氫木香內酯對照品按外標法直接測定的回收率（n＝9）Tab 8 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to internalstandard（n＝9）

表9 用木香烴內酯加f測得去氫木香內酯的回收率（n＝9）Tab 9 Recovery rates of dehydrocostus lactone according to costunolideand f（n＝9）

3.6 樣品含量測定

3.6.1 木香藥材的含量測定 取8批木香藥材各適量，分別按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，再取木香烴內酯、去氫木香內酯對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下進樣測定，計算各批木香藥材中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量。另外，根據f由木香烴內酯含量推算出各批木香藥材中去氫木香內酯的含量，結果見表10。

表10 木香藥材中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 10 Contentsof each com ponent in A.lappa（m g/g，n＝3）

3.6.2 各中藥復方的含量測定 取各中藥復方適量，分別按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液，再取木香烴內酯、去氫木香內酯對照品溶液適量，在“3.1”項下色譜條件下進樣測定，計算3種中藥復方中木香烴內酯和去氫木香內酯的含量。另外，根據f由木香烴內酯含量推算出3種中藥復方中去氫木香內酯的含量，結果見表11。

表11 中藥復方制劑中各成分的含量（mg/g，n＝3）Tab 11 Contents of each com ponent in TCM com pound preparations（mg/g，n＝3）

表10、表11結果表明，對木香藥材及3種含木香的中藥復方，通過常規外標法實測含量與“一測多評”法計算所得含量沒有明顯差異。

4 討論

本研究選用木香烴內酯為內參物，建立該成分與去氫木香內酯的f，并對HPLC儀的λ、流速、柱溫、流動相比例和同規格不同品牌的液相色譜柱，以及不同的HPLC儀進行考察，結果表明本方法簡單、可行，可應用于木香及含木香的中藥復方的多指標成分含量測定。用“一測多評”法所得木香藥材及含木香的中藥復方中各成分含量與常規外標法所測含量沒有明顯差異，說明在去氫木香內酯對照品缺乏的情況下，可通過“一測多評”法實現多成分的同步含量測定[6-9]。

[1] 謝元超，金少鴻.替代對照品法用于丹參和復方丹參片含量測定的研究[J].藥物分析雜志，2007，27（4）：497.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：597、1 094、536.

[3]Yang X，Wang BC，Zhang X，etal.Simultaneous det-ermination of nine flavonoids in Polygonum hydropiper L. samples using nanomagnetic powder three-phase hollow fibre-based liquid-phase m icroextraction combined w ith ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].JPharm Biomed Anal，2011，54（2）：311.

[4]魏華，彭勇，馬國需，等.木香有效成分及藥理作用研究進展[J].中草藥，2012，43（3）：613.

[5] Yang X，Zhang X，Yang SP，etal.Prelim inary antibacterialevaluation of the chem ical compositions in Herba pogostemonisoil[J].Pak JPharm Sci，2013，26（6）：1 173.

[6] 朱晶晶，王智民，匡艷輝，等.一測多評法同步測定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量[J].藥學學報，2008，43（12）：1 211.

[7] 王超群，賈秀虹，陳季，等.中藥三七“一測多評”質量控制方法的系統研究[J].中國中藥雜志，2012，37（22）：3 438.

[8] Gao XY，Jiang Y，Lu JQ，etal.One single standard substance for the determ ination ofmultiple anthraquinone derivatives in rhubarb using high-performance liquid chromatography-diode array detection[J].J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 118.

[9]張雪，李隆云，楊憲，等.不同產地的青蒿藥用成分含量研究[J].中國藥房，2009，20（15）：1 188.

Quality Evaluation ofAucklandia lappaand 3 TCM Com pound Preparations ContainingA.lappaby HPLC M ulti-com ponentsQuantitation by OneM arker

YANG Xian1，LIU Xiao-qin2，ZHANG Xue3，YANG Shui-ping4，YU Xiao-dong1，HE Qi-yi1，ZHAO Ying1（1.College of Life Science，Chongqing Normal University，Chongqing 401331，China；2.Dept.of Applied Chemistry，Chongqing Chem ical Industry Vocational College，Chongqing 400020，China；3.Chongqing Academy of TCM，Chongqing 400065，China；4.College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China）

OBJECTIVE：To established a method for the content determ ination of costunolide and dehydrocostus lactone inAucklandia lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.METHODS：The contents of costunolide and dehydrocostus lactone inA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappawere determined by HPLC multi-components quantitation by one marker，using costunolide as internal standard and the correction factor（f）of costunolide to dehydrocostus lactone. RESULTS：The linear ranges of costunolide and dehydrocostus lactone were 0.101 2-3.036 0μg（r＝0.999 8）and 0.205 6-6.168 0 μg（r＝0.999 9）；thefof costunolide was 1.077 7，and average recovery of dehydrocostus lactone was 99.53%（RSD＝1.11%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The quantitativemethod using onemarker for simultaneous assay is feasible and applied for quality control ofA.lappaand 3 TCM compound preparations containingA.lappa.

Multi-components quantitation by one marker；Correction factor；Costunolide；Dehydrocostus lactone；Aucklandia.lappa；TCM compound preparation；Content determ ination

R284.1；R283；R917

A

1001-0408（2014）11-1030-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.25

重慶市教委科學技術研究項目（No.KJ130618）；重慶師范大學校級基金項目（No.12XLB028）

2013-10-31

2014-01-04）