乳腺癌HER-2檢測的概況與進展*

耿 強 錢曉龍 付 麗

乳腺癌HER-2檢測的概況與進展*

耿 強 錢曉龍 付 麗

人類表皮生長因子受體-2（HER-2/neu）是乳腺癌重要的預后和HER-2靶向藥物治療的預測指標，準確檢測乳腺癌患者的HER-2狀態對臨床診療具有重要意義。目前美國臨床腫瘤學會（ASCO）和美國病理醫師學會（CAP）推薦免疫組織化學（IHC）、熒光原位雜交（FISH）和亮視野原位雜交（BISH）3種HER-2檢測方法。雖存在各自的優勢和不足，但在少數情況下仍無法檢測部分患者HER-2的狀態。銀增強原位雜交（SISH）、多重連接探針擴增技術（MLPA）、定量逆轉錄聚合酶鏈反應（Q-RT-PCR）和RNA原位雜交（RNA-ISH）等新的檢測方法也不斷應用到HER-2檢測中，因其自身的獨特優勢，滿足了部分患者的HER-2檢測需求，因而有很好的臨床應用前景。本文將對這些技術的特點及其優勢和存在的不足進行綜述。

人類表皮生長因子受體-2 HER-2/neu檢測 乳腺癌

人類表皮生長因子受體-2（HER-2/neu）基因是定位于染色體17q12～21上的原癌基因，在20%～30%被確診的乳腺癌患者中存在HER-2基因擴增或蛋白過表達情況［1］。HER-2陽性的乳腺癌患者往往表現為腫瘤惡性程度高、治療效果及預后較差，但其對使用特異的HER-2靶向藥物治療效果較好。因此，準確地檢測乳腺癌患者的HER-2狀態對于臨床進行個體化治療和評估預后至關重要［2］。近年，乳腺癌組織中HER-2狀態檢測的應用技術越來越多。大致分為：1）HER-2蛋白水平的檢測，如免疫組織化學（IHC）；2）HER-2基因DNA水平的檢測，如熒光原位雜交（FISH）、亮視野原位雜交（BISH）、多重連接探針擴增技術（MLPA）等；3）HER-2轉錄水平的檢測，如定量逆轉錄聚合酶鏈反應（Q-RT-PCR）、RNA原位雜交（RNA-ISH）等。本文將對這些技術的特點進行介紹，并對其優勢和存在的不足進行綜述。

1 乳腺癌HER-2檢測的現狀

目前國內外乳腺癌HER-2檢測最常用的方法為IHC和FISH［3］。IHC是一項廣泛而實用的技術，具有檢測成本低、操作簡單、耗時短、可實現自動化檢測和染色后切片便于存檔等優點，閱片時可同時進行組織形態學評價，已成為乳腺癌患者檢測HER-2擴增初篩最常使用的方法［3］。FISH較IHC更特異、更準確并且穩定性更高，尤其是雙探針FISH在原來單一的HER-2探針的基礎上加入了17號染色體著絲粒探針（CEP17）作為內對照，已成為目前HER-2檢測的“金標準”［4］。

IHC是一種半定量的方法，易受到受檢組織固定時間、固定液的選擇、抗體試劑盒的選擇和染色結果判讀的主觀性等諸多因素的影響［5］，因此準確性和穩定性差于FISH。但FISH作為一門專業技術，其操作步驟和設備遠比IHC更復雜，而且還有信號判讀時缺乏組織形態學參考及染色后的切片不宜長時間保存等不足［6-7］。另外FISH的準確性還受17號染色體異倍體及腫瘤異質性等因素的影響［3，8］，亦存在少數病例因標本較少或前期處理不當而無法進行FISH檢測或多次檢測結果均為臨界值，無助于臨床治療。對于FISH無法確定HER-2狀態的標本應積極選擇其他方法（如PCR、RNA-ISH等）進行檢測。

2 乳腺癌HER-2檢測的新進展

2.1 BISH

BISH是近十幾年來出現的HER-2基因檢測的新技術，主要包括顯色原位雜交技術（CISH）、銀增強原位雜交（SISH）等方法。2013年10月ASCO/CAP發布了乳腺癌HER-2檢測指南，將BISH列為乳腺癌HER-2檢測的新技術［1］。

2.1.1 CISH CISH由Tanner等［9］用來首先報道檢測HER-2基因擴增，主要原理是使用地高辛或生物素標記的探針在癌組織切片上進行雜交反應，顯色后在普通光學顯微鏡下觀察HER-2信號的方法。

CISH是一種定量的HER-2檢測方法，與IHC相比CISH特異性更強、準確性和穩定性更高［7］。CISH與FISH相比，CISH獨特的優勢在于可以在普通光學顯微鏡下觀察HER-2基因信號，并能同時進行組織學評價，另外CISH操作步驟和設備較簡單，染色后的切片信號穩定，便于長期存檔［6］。CISH分為單、雙探針CISH。單探針CISH僅含有HER-2基因探針，信號單一且空間分辨率較低，可能會造成HER-2基因低度擴增病例被漏診，當HER-2基因低度擴增的信號數與無擴增的信號數相接近時，亦容易造成誤判。另外，單探針CISH缺乏CEP17作為內對照，無法排除單色探針可能造成的假陰性（17號染色體單體）或假陽性（17號染色體多體）。雙探針CISH在HER-2探針（綠色信號）的基礎上加入CEP17號探針（紅色信號）作為內對照，通過計算綠/紅色信號的比值來表示HER-2基因狀態，從而很好的解決了上述的問題［10］。單、雙探針CISH的評分標準均可參照ASCO/CAP指南中原位雜交（ISH）的標準，Jacquemier等［11］通過分析多中心的乳腺癌HER-2檢測結果，發現CISH和FISH總一致性為98%。因此CISH適合在無FISH檢測條件的實驗室使用［12］。

2.1.2 SISH SISH用于HER-2基因擴增檢測，主要是利用酶促反應原理促進銀離子沉積并凝固到HER-2基因的靶位點而產生精確的顯色信號，對顯色信號分析后獲得HER-2基因狀態的方法［10］。雖與CISH有一些共同優點，如SISH可在普通光學顯微鏡下判讀HER-2基因信號、同時可進行組織學評價、染色后的切片信號穩定亦便于長期保存等，但較CISH準確度更高、耗時更少［7，13］。SISH與FISH相比較，操作步驟簡單易掌握，可實現全程自動化檢測，6 h內可獲得檢測結果［6］，符合臨床快速診斷的要求。并且評分標準完全可以參照ASCO/CAP的評分標準［14］。SISH分為單、雙探針SISH。單探針SISH的缺點類似于單探針CISH，雙探針SISH引入CEP17探針作內對照，已被FDA批準用于HER-2檢測。據相關文獻報道，SISH檢測HER-2基因狀態與FISH的符合率達87%～97%［14-15］。因此SISH可能在未來成為乳腺癌HER-2檢測的常規方法。當然作為一種新技術SISH也有一些不足，如檢測成本較高、銀染的HER-2基因信號為黑色而內對照CEP17信號是紅色造成信號對比不夠清晰［10］。

2.2 MLPA

MLPA的檢測原理主要為使用熒光標記的探針與HER-2基因的DNA進行雜交，之后通過連接、PCR擴增，產物經毛細管電泳分離及數據收集，對收集的數據使用軟件進行分析后得出檢測結果。該技術操作簡單并可實現自動化檢測，還具有檢測成本低廉、耗時短、靈敏度高和特異性強等優點［6，16-17］。特別適合用來檢測片段化的DNA樣本，如中性福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的腫瘤組織，并且少量標本便可實現檢測目的。在HER-2基因檢測的同時，MLPA可對17號染色體上不同區域的多個靶基因進行檢測，有利于17號染色體非整倍體的檢測并獲得不同區域的靶基因異常擴增信息［7］。但是該技術也存在一些缺點，如檢測標本缺乏組織形態學的評價、DNA提取中難免混有非浸潤性癌組織的DNA、可能受到靶序列或擴增產物的交叉污染等。Moelans等［16］發現MLPA和FISH/CISH有很好的一致性，是一種可靠的HER-2檢測方法。因此對于組織較少無法進行FISH/CISH檢測或需同時檢測17號染色體上多個基因的乳腺癌病例可選擇MLPA進行檢測。

2.3 Q-RT-PCR

Q-RT-PCR在HER-2基因檢測的原理是將HER-2基因信使核糖核酸（mRNA）逆轉錄成互補DNA（cDNA）再進行實時PCR反應，通過測定樣品中特定mRNA含量，繼而反映細胞內HER-2基因表達量［18］。該方法具有PCR的普遍優點，如檢測成本低廉、特異性強、靈敏度高、操作簡單和自動化檢測等［19］，尤其適合對新鮮的冰凍組織進行檢測，并且少量組織便可獲得檢測結果。但是該技術最大的缺點是在DNA/RNA提取過程中不可避免的混入非浸潤癌成分，也不能徹底消除腫瘤異質性和17號染色體異倍體對檢測結果的影響，另外因組織固定等原因導致HER-2基因mRNA片段降解和操作中RNA酶的污染，也可能干擾檢測結果，造成檢測結果的不穩定性。有研究發現Q-RT-PCR檢測HER-2擴增和IHC一致率可達97%［20］，但也有研究表明相比于IHC/FISH，Q-RT-PCR更易造成HER-2的假陰性［21］。可見Q-RT-PCR進行HER-2檢測還存在爭議。Q-RT-PCR因較少的標本便能進行HER-2基因的高通量檢測，對乳腺癌的治療及預后可能有較好的應用前景。

2.4 RNA-ISH

RNA-ISH進行HER-2檢測的原理與DNA-ISH類似，通過使用地高辛或熒光素標記的探針與被檢組織中HER-2基因的mRNA片段進行雜交反應，然后進行顯色或激發光照射，在普通光學顯微鏡或熒光顯微鏡下對mRNA信號進行定量，繼而獲得被檢組織HER-2基因表達情況。RNA-ISH是一種特異而敏感的檢測方法，可對新鮮的冰凍組織或FFPE組織進行快速檢測，檢測需要標本量較少并且全程自動化檢測［22］。但是作為一種新技術，RNA-ISH也有一些不足，如檢測標本mRNA可能降解、操作過程中可能受到RNA酶的污染、判讀結果時缺乏組織形態學資料等。西班牙Alba等［23］發現RNA-ISH與FISH和IHC的一致性分別為96.5%和95.2%。所以RNA-ISH也可能是檢測HER-2狀態的一種比較可靠方法。

3 結語

綜上所述，準確檢測乳腺癌患者HER-2的狀態是乳腺癌患者預后評估和制定有效治療方案的先決條件，對乳腺癌的診療具有重要的指導作用。隨著研究的深入，HER-2檢測技術也處于不斷發展中。目前IHC、FISH、CISH等常規的HER-2檢測技術因自身的不足和17號染色體異倍體等局限性而無法滿足一些患者HER-2的檢測需求。因此不斷發展和評估新的實用技術，如SISH、MLPA、Q-RT-RCR和RNA-ISH等彌補傳統技術的不足，為臨床診療工作提供參考，對乳腺癌患者更好地進行個體化治療具有重要意義。

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（2014-03-08收稿）

（2014-04-16修回）

Current situation and development of HER-2 testing in breast cancer

Li FU;E-mail:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

Human epidermal growth factor receptor 2(HER-2/neu)is an important prognostic predictor and the key predictor of anti-HER-2 therapy of breast cancer.Accurate testing of HER-2 status for breast cancer patients is important in clinical practice.As of this writing,the American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists recommend three methods for HER-2 detection,namely,immunohistochemistry,fluorescence in situ hybridization,and bright-field in situ hybridization.The abovementioned methods have their own advantages and disadvantages.New methods,such as multiplex ligation-dependent probe amplification,quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,and RNA in situ hybridization,are currently applied to detect HER-2 status.New technologies not only make up for the shortcomings of routine methods but also have unique benefits that can meet the demands for HER-2 testing of some breast cancer patients.Thus,these methods are promising for clinical applications and can improve clinical diagnosis and treatment.The characteristics,advantages,and drawbacks of these technologies are introduced and reviewed in this paper.

HER-2,HER-2/neu testing,breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20140377

天津醫科大學腫瘤醫院乳腺病理研究室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學基金重點項目（編號：30930038）資助

付麗 fulijyb@hotmail.com

Qiang GENG,Xiaolong QIAN,Li FU

This study was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

張亻 刡）

耿強 碩士研究生。研究方向為乳腺癌生長侵襲轉移機制。

E-mail：jedgeng@163.com

·特約綜述·