136例中國北方漢族人群經典型霍奇金淋巴瘤與EB病毒感染的相關性研究*

付騫千 紀洪媛 張甜甜 高大林 吳 玉 劉 樂 翟瓊莉

136例中國北方漢族人群經典型霍奇金淋巴瘤與EB病毒感染的相關性研究*

付騫千①紀洪媛②張甜甜①高大林①吳 玉③劉 樂①翟瓊莉①

目的：EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與多種腫瘤的發生關系密切，現已證實EBV感染與經典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma，CHL）發生關系尤為密切，但CHL患者中EBV檢出率因種族、地域、性別和年齡的不同而有所差異，本研究目的在于探討中國北方地區CHL發病與EBV感染的相關性。方法：用原位雜交的方法檢測136例確診為CHL病例中EBV編碼的小RNA（Epstein-Barr virus encoded RNA，EBER）。結果：在136例CHL患者中EBER的總陽性率為28%（37/136），其中混合細胞型（mixed cellularity，MC）陽性率最高為49%（23/47）（P＜0.001），其次為富于淋巴細胞型（1ymphocyte rich，LR）30%（3/10），結節硬化型（nodular sclerosis，NS）14%（10/73），淋巴細胞消減型（1ymphocyte depletion，LD）0例（0/2）。CHL發病年齡呈單峰分布，主要在21～30歲年齡組。NS型在21～30年齡組出現一個明顯單峰，而MC型在41～50歲年齡組存在一個略低的峰，EBER陽性率在0～10歲和41～50歲這兩個年齡組分別有兩個峰值（21.6%和24.3%）。結論：中國北方漢族人群CHL的發病與EBV的感染有一定的關系，其中以MC與EBV的關系較為密切。

經典型霍奇金淋巴瘤 EB病毒 原位雜交 EBV編碼的小RNA

1987年Weiss等［1］用Southern Blot方法首次在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）組織中檢測出EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的DNA，此后，隨著免疫組化、PCR以及更為敏感的原位雜交方法的發展，流行病學、分子生物學及免疫學等方面的研究結果均顯示：某些類型的HL確實與EBV感染存在密切相關性，但是不同地理環境、社會經濟、種族人群、年齡的HL患者與EBV相關性有很大的差異［2］。目前國內相關研究多來自新疆及沿海地區，故本研究采用原位雜交的方法回顧性檢測了本院收治的136例漢族經典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin Lymphoma，CHL）患者中EBV編碼的小RNA（Epstein-Barr virus Encoded RNA，EBER），以探討中國北方漢族人群經典型霍奇金淋巴瘤與EBV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本來源及其臨床資料

收集天津醫科大學腫瘤醫院2000年12月至2013年12月期間136例CHL病例，由兩名病理醫生復查病理切片，完善免疫組化并收集臨床資料，所有病例均按2008年WHO淋巴瘤標準分類。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 以上標本均經常規中性福爾馬林固定，石蠟包埋。采用表面經硅化包被的防脫載玻片，4 μm連續切片備用。

1.2.2 免疫組化檢測 每例標本均進行CD3、CD15、CD20、CD30、Pax-5、LCA等免疫組化染色，所有一抗試劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司即用型抗體。染色采用EnVision兩步法：切片常規脫蠟水化，組織抗原經高壓熱修復后加入3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗3次；滴加一抗，4℃過夜；PBS沖洗后滴加二抗室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，蘇木素復染，氨水返藍，梯度酒精脫水后中性樹膠封片。每次染色均設空白對照（PBS）和陽性對照。

1.2.3 EBER原位雜交 試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司代理的美國PanPath公司REMBRANT原位雜交試劑盒。寡核苷酸探針為地高辛標記。選取已知EBV陽性的鼻咽癌組織標本為陽性對照，以PBS液代替雜交液作為陰性對照。具體步驟按照操作說明進行：石蠟切片脫蠟后過無水乙醇5 min，自然干燥；經胃酶濕盒消化37℃30 min后梯度乙醇脫水（70%、95%、100%），自然干燥；滴加適量探針并加蓋蓋玻片，橡膠水泥封片37℃濕盒過夜孵育16 h；除去橡膠水泥后以PBS緩沖液浸泡切片10 min至蓋玻片脫落，再用PBS液清洗2 min×3次；滴加適量辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體37℃孵育30 min，PBS液沖洗3次，蒸餾水浸泡1 min；DAB顯色，蘇木素復染，氨水返藍，梯度酒精脫水后中性樹膠封片。

1.2.4 結果判斷 CHL瘤細胞指雙核經典Reed-Ste rnberg細胞（R-S細胞）及變異型R-S細胞。免疫組化陽性判斷標準：CD15、CD30均為瘤細胞胞膜棕黃色著色，Pax-5為瘤細胞胞核棕黃色著色；EBER檢測陽性判斷標準：腫瘤細胞核內出現棕黃色顆粒者為陽性細胞，而胞質和胞膜著色及背景細胞著色不能視為陽性。高倍視野下（×400）觀察到1個陽性細胞以上為陽性病例（圖1）。

圖1 CHL組織中Pax-5、CD30，EBER檢測 （Envision×400）Figure 1 HE staining and immunohistochemical patterns of Pax-5，CD30，and EBER

1.3 統計學處理

采用SPSS 12.0軟件進行統計處理，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析

136例CHL患者中，NS型73例（55%）明顯多于其他亞型（P＜0.001），其次為MC型47例（36%），LR型10例占8%，LD型發病率最低，僅2例（1%），另外未能分類（not otherwise specified，NOS）4例（表1）。

在136例CHL中男性患者84例，女性患者52例，男女比例1.6：1。年齡分布：0～10歲組8例（5.9%），11～20歲組 23例（16.9%），21～30歲組 34例（25.0%），31～40歲組25例（18.4%），41～50歲組21例（15.4%），51～60歲組15例（11.0%），61～70歲組9例（6.6%），71～80歲組1例（0.7%），中位年齡為31.5（4～72）歲。年齡構成比呈現單峰分布，主要在21～30歲年齡組發病例數最多（P＜0.001）。其中NS亞型在21～30歲年齡組出現一個明顯高峰，而MC亞型在41～50歲年齡組有一個略低的峰（圖2）。

2.2 EBER結果分析

136例患者中EBER原位雜交檢測顯示陽性結果37例（27.2%），其中男性26例，女性11例，男女比例2.4：1。37例EBER陽性病例中MC型23例（64%），NS型10例（28%），LR型3例（8%），LD型0例，NOS型1例。MC型明顯多于其他類型（P＜0.001），兩組中男女性別比差異無統計學意義（P=0.212），中位年齡差異無統計學意義（表1）。

EBER陽性組中年齡分布：0～10歲組8例（21.6%），11～20歲組3例（8.1%），21～30歲組4例（10.8%），31～40歲組3例（8.1%），41～50歲組9例（24.3%），51～60歲組4例（10.8%），61～70歲組5例（13.5%），71～80歲組1例（2.7%），中位年齡42（4～72）歲。EBER陽性病例在0～10歲和41～50歲這兩個年齡組分別有兩個峰值（21.6%和24.3%，圖3），EBER陽性病例僅在21～30多年齡組存在單峰年齡組分布上差異有統計學意義（P＜0.001）。

表1 136例中國北方漢族CHL患者石蠟組織中EBER表達與性別、組織學分型間的關系Table 1 Correlationship between EBER expression and sex,and the histologic grade in 136 cases of patients with CHL from Northern Chinese Han population

圖2 136例CHL總體和NS、MC亞型在各年齡組的發病情況Figue 2 Age distribution of all patients and NS、MC subtypes in consecutive 10-year intervals

圖3 EBER陽性病例在0～10歲年齡組和41～50歲年齡組有兩個峰值，EBER陰性病例只在21～30年齡組存在單峰Figure 3 The incidence of EBER positive group identified a bimodal age distribution with two peaks at the first and fifth decades respectively, while only single age peak at the third decades in EBER negative group

3 討論

CHL發病率占惡性腫瘤的1%，占淋巴瘤發病率的30%［3］，高加索人發病率最高，其次是南美和西班牙人，而亞洲人發病率最低［2］。其原因可能是由社會經濟狀況、種族背景、遺傳易感性不同而造成的。在西方一些發達國家CHL的發病率呈現雙峰分布（混合細胞型），第一個峰在25歲左右，第二個峰在60歲左右，而有關東方人CHL發病率的研究報道顯示第一個峰通常出現在兒童時期，第二個峰出現在老年時期。這種流行病學特點也提示第一個高峰可能與EBV感染因素有關，在發展中國家，EBV初次感染發生較早，而在發達國家由于社會經濟等多種原因使得初次感染延遲［4］。本研究顯示在我國北方地區漢族人群CHL發病年齡分布呈現偏態單峰分布，在21～30歲年齡組發病數最多，研究結果有統計學意義（P＜0.001），此峰值與Huang等［5］對157例中國北方CHL患者的研究結果一致，說明本研究中我國北方地區漢族人群CHL的第一個發病高峰與西方國家的報道相同。但是本研究未顯示第二個發病峰值，且單獨對各種亞型分析，特別是MC亞型，也未見明顯雙峰，這可能是由于本研究對象中老年病例較少所致。

檢測EBV感染的常用方法有免疫組化法檢測潛伏膜蛋白（laten membrane proteins，LMP-1），原位雜交法檢測EBER以及PCR方法檢測EBV的DNA，3種方法中以PCR方法最為敏感，但結果不穩定，易受外界因素影響，可重復性差，易出現假陰性或假陽性。并且此技術手段不能區分病毒DNA來自于腫瘤細胞還是周圍其他淋巴細胞，只能解釋為有EBV的感染，是否有RNA的轉錄以及蛋白表達卻無法得知，因此特異性較低［6］。免疫組化方法可以檢測EBV的蛋白產物LMP-1并將其定位于H/RS細胞的胞膜或胞質內，但是對于細胞內低拷貝數RNA的EBV檢測存在一定的假陰性率。相對而言原位雜交的方法檢測的是EBV編碼的小RNA，這種小分子RNA結構穩定且不容易被降解，主要反映DNA的轉錄情況，因此在病毒潛伏期和復制期均有表達，其陽性信號定位于H/RS細胞核上，呈棕黃色顆粒，易于辨認。因此在EBV感染的檢測上，采用原位雜交檢測EBER的方法是檢測EBV感染最為敏感的指標［7］。因此本實驗以原位雜交作為檢測手段。

EBV感染與CHL的相關性在世界很多地方都有研究，然而目前所報道的CHL中的EBV檢出率在發達國家及發展中國家存在很大差異，西方檢出率為29%～79%［8-11］，我國學者研究顯示CHL組織中EBV陽性率為52%～82%。本實驗中EBER陽性率為27.2%（37/136），雖略低于以往國內報道，但與Zhang等［12］對19例中國地區漢族HL患者EBER陽性率（26.3%）的研究結果及Huang等［5］對157例中國北方CHL患者的研究結果相近。我們分析原因可能有以下幾點：

首先，EBV的感染情況可因地域不同而存在差異。齊宗利等［6］對廣州地區39例HL中EBV進行測定結果顯示EBER陽性率為69.2%。鄭雄偉等［13］對福建地區74例HL蠟塊進行EBV檢測陽性率為51.4%，這兩組數據略高可能是由于沿海地區人口流動頻繁易造成EBV感染。

其次，種族背景的不同也會影響EBV的易感性。藏素紅等［14］對27例維吾爾族HL患者采用原位雜交檢測EBER陽性率為81.5%（22/27）。李迅等［15］對40例維吾爾族HL患者標本進行EBER檢測，陽性率為65.0%（26/40），明顯高于本研究結果，我們猜測維吾爾族人HL患者EBV的檢出率相對多于其他民族，可能與其民族具有部分北歐血統有關。這一推論也可以和高加索人EBV檢出率最高的研究結果相吻合［2］。

第三，EBV感染情況與CHL組織學亞型關系密切。在本組病例中MC和LR型EBV陽性率較高，分別為49%（23/47）和30%（3/10），表明MC型和LR型與EBV感染的相關性最為密切，這也與眾多研究結果相似［7，13］。但本研究整體病例以原本EBV陽性率（14%）略低的NS型為主（73/136），因此使得總體EBV檢出率下降。

第四，不同年齡組的患者EBV檢出率差異較大，兒童與老年CHL患者EBV感染率更高［16］。西方發達國家兒童HL患者的EBV感染率僅有20%～25%［17］，而我國90%兒童HL患者都存在EBV的感染［13］。Zhou等［18］對中國104例兒童HL和52例成人HL的EBV感染進行了分析，發現89%兒童HL和38%成人HL有EBV感染。特別是10歲以下兒童感染率可高達95%，并且兒童HL EBV感染與組織學類型無關，即每種類型的HL均與EBV有密切關系，在本研究中8例0～10歲年齡組的患者EBER均為陽性，這也提示兒童HL是EBV相關的獨立疾病。也有部分學者認為兒童與老年人EBV+HL發病率較高可能與兒童及老年人免疫能力相對低下，環境因素及人體基因易感性有關［19］。以往的研究結果顯示初次感染EBV時患者年齡是罹患HL的重要因子，在兒童期感染EBV的患者（多見于發展中國家），多無明顯癥狀，病毒與患者呈長期伴隨關系；如青少年時期初次感染EBV（多見于發達國家）常會患傳染性單核細胞增多癥，而此病又會使年輕人患HL的危險性增加至少2.5倍［20］。而老年人患HL的原因可能是由于潛伏性的EBV感染與宿主免疫系統失衡所致。本組研究中雖然0～10歲組和71～80歲組共9例患者EBER均為陽性，但占總體病例百分比很小，因此導致總體EBV檢出率低于其他國內報道。

最后，隨著經濟的發展，生活條件改善，與之相應的EBV感染情況也會得到控制，這也可能是本研究中EBER陽性率較低的部分原因。同時本研究發病峰值在21～30歲年齡組也可以由經濟發展帶來的EBV延遲感染來解釋。

綜上所述，CHL與EBV感染關系密切，中國北方漢族人群CHL特別是MC亞型發病與EBV感染相關性更大，兒童和老年患者EBV檢出率可高達100%。檢測EBV的狀態對于CHL診斷及鑒別診斷十分重要，EBV在HL發病機制中的作用仍在研究之中。

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（2014-03-11收稿）

（2014-05-01修回）

Association between classical Hodgkin's lymphoma and Epstein-Barr virus infection in Northern Chinese Han population

Qianqian FU1,Hongyuan JI2,Tiantian ZHANG1,Dalin GAO1,Yu WU3,Yue LIU1,Qiongli ZHAI1

Qiongli ZHAI;E-mail:zhaiqiongli@126.com
1Department of Pathology,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Sino-American Diagnostic and Therapeutic Center for Hematological Malignancies(Tianjin),Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060;2Department of Pathology,Tianjin Jixian People's Hospital,Tianjin 31900;3Department of Endocrinology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

Objective:The occurrence of numerous tumors,particularly classical Hodgkin's lymphoma(CHL),is related with Epstein-Barr virus(EBV)infection.However,the incidence of CHL and its association with EBV varies significantly with ethnicity,geographic location,sex,and age.This study investigated the association of EBV infection with CHL in Northern Chinese Han population.Methods:EBV-encoded small RNA(EBER)was detected in 136 cases of CHL through in situ hybridization.Results:A total of 37 cases were EBER positive(28%).The mixed cellularity(MC)subtype had the highest positive EBER rate of 49%(23/47;P<0.001),followed by lymphocyte-rich subtype with 30%(3/10),nodular sclerosis(NS)subtype with 14%(10/73),and 1ymphocyte depletion with 0%(0/2).Our study identified a single age distribution in the third decade.Moreover,NS subtype showed an evident single peak in the third decade.However,MC subtype had a lower peak in the fifth decade.The incidence of EBER showed a bimodal age distribution with two peaks in the first and fifth decades(21.6%and 24.3%,respectively).Conclusion:CHL in Northern Chinese Han population was associated with EBV infection,particularly the MC subtype.

classical Hodgkin's lymphoma,Epstein-Barr virus,in situ hybridization,Epstein-Barr virus encoded RNA

10.3969/j.issn.1000-8179.20140394

①天津醫科大學腫瘤醫院病理科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，中美淋巴血液腫瘤診治中心（天津），天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）；②天津市薊縣人民醫院病理科；③天津醫科大學總醫院內分泌科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81272361）資助

翟瓊莉 zhaiqiongli@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81272361)

鄭莉）

付騫千 病理學與病理生理學專業碩士。研究方向為淋巴瘤病理診斷。

E-mail：13694719472@126.com

·綜 述·