響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解提取玉米黃色素工藝參數(shù)

鐘振聲，高怡然

（華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640）

玉米蛋白粉俗稱黃粉子，是玉米淀粉加工過(guò)程中的副產(chǎn)品，呈淡黃色，其蛋白質(zhì)含量較高，含少量碳水化合物、脂肪和灰分，還含有一定量的玉米黃色素[1-2]，隨著我國(guó)玉米深加工業(yè)的發(fā)展，玉米蛋白粉的產(chǎn)出量也在逐年增加，預(yù)計(jì)2009年可達(dá)400 萬(wàn)t 以上，資源量相當(dāng)可觀。但目前我國(guó)絕大多數(shù)企業(yè)僅將玉米蛋白粉作為飼料利用，附加值很低，若能利用玉米蛋白粉進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品，則可大幅度提高玉米深加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，延長(zhǎng)玉米產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)玉米經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[2-3]。

玉米黃色素是一種天然食用色素，屬異戊二烯類，主要由玉米黃素（3，3′-二羥基-β-胡蘿卜素）、隱黃素（3-羥基-β-胡蘿卜素）及葉黃素（3，3′-二羥基-α-胡蘿卜素）等組成，其中玉米黃素是黃玉米所含的主要色素，這些組分均為類胡蘿卜素的混合物[4]。玉米黃色素可用于人造黃油，人造奶油等食品中，其著色效果良好，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)玉米黃色素具有不可多得的營(yíng)養(yǎng)保健功效，因此在食品、飲料、醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用前景[5-6]。

玉米黃色素的提取，一般是利用有機(jī)溶劑如石油醚，丙酮，已烷，乙醇等對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行萃取，并經(jīng)過(guò)濃縮而獲得色素制品[7]。據(jù)文獻(xiàn)可知，玉米黃色素在玉米蛋白粉中通常與蛋白結(jié)合呈絡(luò)合物的狀態(tài)存在，如果單純用溶劑浸提，得到的玉米黃色素量較少[8-10]。

本研究采用蛋白酶作為輔助，以無(wú)水乙醇浸提玉米蛋白粉提取玉米黃色素。在提取過(guò)程中，影響提取效率的因素很多，本文運(yùn)用響應(yīng)面法[11-13]優(yōu)化酶解輔助提取玉米黃色素的工藝參數(shù)，力圖提高黃色素的提取率。響應(yīng)面法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，可以快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉：工業(yè)品；中性蛋白酶：購(gòu)于北京鼎國(guó)生物科技有限公司；無(wú)水乙醇為分析純?cè)噭?/p>

752-P 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上?，F(xiàn)科儀器有限公司；SHZ-82A 空氣搖床：常州奧華儀器有限公司；TGL-16gR 冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；pHS-25型精密pH 計(jì)：上海精科儀器廠；U3010 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本HITACHI 公司。

1.2 方法

1.2.1 溶劑選擇及最大吸收波長(zhǎng)的確定

稱取2.0 g 玉米蛋白粉，加入20 mL 溶劑，室溫浸提1.5 h，抽濾。取濾液于400 nm～500 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行波譜掃描，繪制波長(zhǎng)-吸光度曲線。測(cè)出色素吸收峰所對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)后，在此波長(zhǎng)下測(cè)定不同條件提取出來(lái)的色素的吸光度。

1.2.2 玉米黃色素的提取

取25 g 玉米蛋白粉，加約400 mL 蒸餾水，調(diào)pH 7.0，加入1 mL 中性蛋白酶，40 ℃下水解2 h，離心殘?jiān)?0 ℃烘箱熱風(fēng)干燥。分別取玉米蛋白粉2.0 g 于5 個(gè)三角燒瓶中，分別加入20 mL 無(wú)水乙醇，然后置于45 ℃恒溫水浴中，分別浸提1、2、3、4、5 h。浸提液定容至100 mL，測(cè)定其吸光度。

1.2.3 玉米黃色素提取率的測(cè)定

采用 AACC（American Association of Cereal Chemists）法[14]，用總胡蘿卜素的含量表達(dá)樣品中黃色素的有效含量。準(zhǔn)確稱取樣品0.6 g，加入40 mL 水飽和丁醇溶液，浸提3 h，并不時(shí)輕輕振蕩。用濾紙過(guò)濾得上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在445 nm 處測(cè)吸光度。以提取物吸光度/玉米黃粉吸光度來(lái)表達(dá)提取率。測(cè)得玉米黃粉吸光度為0.710。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

按照1.2.1 的方法，用無(wú)水乙醇作為提取溶劑，測(cè)定玉米黃色素的波長(zhǎng)-吸光度曲線如圖1 所示。

可見(jiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為445 nm。以下實(shí)驗(yàn)均為在此波長(zhǎng)下的吸光度值。

2.2 蛋白酶水解的單因素試驗(yàn)

圖1 玉米黃色素的波長(zhǎng)-吸光度曲線Fig.1 Wavelength-absorbance curve of yellow pigment

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，類胡蘿卜素在40 ℃以下較穩(wěn)定[15]，45 ℃時(shí)玉米蛋白粉中的游離玉米黃色素受到溫度的影響可能損失從而降低得率。本實(shí)驗(yàn)使用的中性蛋白酶的最適宜溫度為40 ℃左右。鑒于這兩點(diǎn)考慮，確定本實(shí)驗(yàn)的水解溫度為38 ℃。中性蛋白酶的最適pH 為6～7，在這個(gè)范圍里的pH 對(duì)玉米黃色素提取效率影響不大，故確定水解試驗(yàn)pH7.0。

2.2.1 水解時(shí)間的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其底物濃度為3%，酶濃度為1%，pH7.0，38 ℃下水解，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 水解時(shí)間對(duì)玉米黃色素提取效率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的水解時(shí)間段為4 h～8 h，因此，選擇4、6、8 h 3 個(gè)水平做以下Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 底物濃度的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其酶濃度為1%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 底物濃度對(duì)玉米黃色素提取效率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的底物濃度范圍為3%～7%，因此，選擇底物濃度3%，5%，7 % 3 個(gè)水平做以下Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 酶濃度的影響

分別取5 g 玉米蛋白粉，使其底物濃度為5%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶濃度對(duì)玉米黃色素提取效率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度變化比較大的酶濃度范圍為2.2 %～3 %，故選擇酶濃度2.2%，2.6%，3%3 個(gè)水平做以下Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白酶水解過(guò)程

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

三水平三因素的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。共有15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12 個(gè)位析因點(diǎn)，3 個(gè)位零點(diǎn)以估計(jì)誤差。因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results analysis of Box-Behnken experiment

將以上試驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果擬合得到響應(yīng)值A(chǔ)445 和各因子（X1：水解時(shí)間；X2：底物濃度；X3：酶濃度）的回歸方程為：

提取率= -52.983 01-7.509 54X1-17.159 57X2+146.62338X3-0.46377X1X2+1.42699X1X3+13.4375X2X3+0.668 90X12-1.447 80X22-43.33X32

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

響應(yīng)面的回歸系數(shù)分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 二次多項(xiàng)式回歸系數(shù)Table 3 Regression coefficients of quadratic polynomial

表4 響應(yīng)曲面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of quadratic response surface regression model

從表4 可知，該二次回歸模型顯著（p=0.004 5＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.384 5），說(shuō)明該模型和試驗(yàn)擬合良好，可用于酶解提取玉米黃色素試驗(yàn)的分析和預(yù)測(cè)。模型的可信度分析見(jiàn)表5。

表5 模型的可信度分析Table 5 Reliability analysis of model

其中信噪比為12.220＞4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高，試驗(yàn)誤差較小。

根據(jù)回歸方程做響應(yīng)面，考察擬合的響應(yīng)面的形狀，分析水解時(shí)間、底物濃度和酶濃度對(duì)玉米黃色素的提取率，其響應(yīng)面如圖5、圖6 和圖7 所示。

圖5 水解時(shí)間，底物濃度及其交互作用對(duì)玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.5 Effects of hydrolysis time，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖6 水解時(shí)間，酶濃度及其交互作用對(duì)玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.6 Effects of hydrolysis time，enzyme concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖7 酶濃度，底物濃度及其交互作用對(duì)玉米黃色素提取率的影響和等高線Fig.7 Effects of enzyme concentration，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

圖5 表示水解時(shí)間和底物濃度對(duì)提取率的交互作用情況，由圖5 中等高線圖可知，等高線沿水解時(shí)間方向變化相對(duì)密集，說(shuō)明水解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響比底物濃度大；圖6 表示水解時(shí)間和酶濃度對(duì)提取率的交互作用情況，圖6 中，等高線沿酶濃度方向變化相對(duì)密集，說(shuō)明酶濃度對(duì)響應(yīng)值的影響比水解時(shí)間大；由圖7 可知，等高線密度沿酶濃度和底物濃度方向相當(dāng)，可知對(duì)響應(yīng)值的影響相當(dāng)。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解輔助乙醇提取玉米黃色素的工藝，以水解時(shí)間、底物濃度、酶濃度為主要因素進(jìn)行Box Behnken 試驗(yàn)，建立了玉米黃色素提取率的回歸方程為

提取率= －52.983 01－7.509 54X1－17.159 57X2+146.623 38X3－0.463 77X1X2+1.426 99X1X3+13.437 5X2X3+0.668 90X12－1.447 80X22－43.33X32

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取工藝中水解時(shí)間為8 h，底物濃度為4.48 %，酶濃度為2.52 %時(shí)提取率達(dá)到81.053%，與Design expert 軟件預(yù)測(cè)的81.996%僅相差1.15%，說(shuō)明該模型可靠。在各影響因子中，水解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響比底物濃度大，酶濃度對(duì)響應(yīng)值的影響比水解時(shí)間大，酶濃度和底物濃度對(duì)響應(yīng)值的影響相當(dāng)。

經(jīng)過(guò)用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法輔助提取玉米黃色素，提取率比傳統(tǒng)的乙醇提取法（提取率16.125%）提高了5 倍。

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