HPLC-MS/MS法檢測家禽雞可食組織中阿奇霉素的殘留量

（金華市質量技術監督檢測院，浙江金華321000）

目前大多數獸藥殘留分析采用了HPLC法，但HPLC至今仍缺少可滿足獸藥殘留分析要求的通用型檢測器。HPLC—EC和HPLC—MS法樣品前處理簡單[1-2]，選擇性好，靈敏度高，現在一般地區級以上的檢測部門均已配備HPLC-MS/MS，然而作為食品中阿奇霉素殘留測定的標準卻仍未建立，本文參考國內外有關文獻及數據的基礎上[3-6]，首次建立高效液相——質譜聯用（HPLC-MS/MS）法測定雞可食組織中阿奇霉素的殘留，為保證動物源性食品安全提供一種快捷、靈敏、可靠、準確的檢測技術，也為藥物在家禽體內的藥代動力學研究提供定量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗與儀器

阿奇霉素標準品，50 mg，97.0%，20℃保存，德國dr.ehrenstorfer公司，由上海安譜科學儀器有限公司代購；所用試劑除乙腈、甲醇為色譜純，除水為超純水外其余均為國產分析純。

液質聯用儀LC、1200 DAD和6410B QQQ質譜檢測器：美國Agilent1200公司；色譜柱XDB-C18，1.8μm，2.1×100 mm：美國Agilent公司；高速冷凍離心機，BIOFUGE STRATOS：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

精密稱取雞可食組織2.0 g樣品磨碎，加入勻漿介質磷酸鹽緩沖液（pH7.5）4 g，勻漿機5 000 r/min勻漿10 min，制成勻漿組織液；準確稱取1.5 g勻漿組織液（相當于0.5 g雞可食組織）于10 mL離心管中，再加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，旋渦震蕩2 min，加含5%異丙醇的氯仿4 mL，旋渦震蕩萃取10 min，離心（10 000 r/min）5 min， 精密量取有機層2.0 mL，45℃水浴氮氣流吹干，加流動相100 μL渦旋2 min，4 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜過濾，超聲波清洗器中超聲20 min，取5 μL進樣HPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18， 1.8 μm，2.1×30 mm；檢測器：Agilent 1200 DAD檢測器；流動相：A：60%水（0.1%甲酸），40%甲醇；流量：0.4mL/min；進樣量：5μL；柱溫：25℃；檢測波長：195 nm。

1.2.3 肉雞組織標準曲線的制備

準確稱取1.5 g勻漿液（相當于雞可食組織0.5 g）于10 mL離心管中，加入阿奇霉素標準溶液，使組織中阿奇霉素濃度分別為 0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.4、0.8、1.0 μg/mL的系列標準組織樣品。旋渦震蕩10 min。后續操作同樣品處理方法。

1.2.4 組織加標回收率測定

取空自雞肉組織樣品，加阿奇霉素工作液配制成0.05、0.10、0.50 μg/g 3 個水平的雞肉樣品，按標準曲線制備方法處理后進行測定，同時將對應3個水平的阿奇霉素用流動相溶解作HPLC-MS/MS分析，每個樣品均重復5次，以峰度比定性，按定量離子峰面積定量來求得藥物回收率。

1.2.5 穩定性試驗

按組織加標回收率方法制得0.05、0.10、0.50 μg/mL（或μg/g）3個水平的阿奇霉素濃度，按標準曲線制備的方法，每個批次作8個重復，共作5個批次，測得實際濃度，求出每個濃度的批內和批間變異系數（RSD）。

2 結果與分析

2.1 色譜結果

在阿奇霉素液質聯用參數研究選定的優化色譜條件下，阿奇霉素保留時間在1.2 min～1.4 min之間，添加標準品的樣品色譜峰峰形較佳，為基線分離峰。

優化后，質譜的相關色譜條件為a）電離方式：電噴霧電離，正離子；b）離子噴霧電壓：400 V；c）霧化氣：氮氣，45 psi；d） 干燥氣： 氮氣， 流速11 L/min， 溫度350℃；e）碰撞器：氮氣；f）掃描模式：MRM，母離子 m/z 749.5，定量離子 m/z589.5，定性離子 m/z157.8；g）駐留時間：200 ms；h） 裂解電壓 160 V；i） 碰撞能量：m/z 749.5＞589.5為20 V，m/z749.5＞157.8為20 V。

2.2 標準曲線與最低檢測限

圖1 阿奇霉素標準液總離子流、特征離子峰度Fig.1 Azithromycin standard solution total ion current，characteristic ion peaks

雞肉組織中的阿奇霉素工作液在選定的色譜條件下用HPLC-MS/MS測定，以出現藥物峰的最低組織藥物濃度作為判定藥物在組織中的最低檢測限。標準濃度在0.001 μg/mL時，生雞蛋加標在1.231 min處出現一小峰，可作為最低檢測限（LOD）。當加標后最終藥物濃度在低濃度范圍 0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 與高濃度范圍 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL 內，縱軸色譜峰面積（S），與橫軸各濃度（C）分別呈現良好的線性關系，得到各組織標準曲線的線性回歸方程和相關系數，阿奇霉素的最低定量限（LOQ）0.5 pg/mL，制備相關數據及標準曲線見表1、表2，圖2、圖3。

圖2 阿奇霉素的標準曲線（高濃度加標區間）Fig.2 Preparation of azithromycin curves（high concentration standard interval）

表2 標準曲線制備（低濃度加標區間）Table 2 Preparation of standard curves（low concentration standard interval）

圖3 阿奇霉素的標準曲線（低濃度加標區間）Fig.3 Preparation of azithromycin curves（low concentration standard interval）

2.3 方法學考察

2.3.1 回收率試驗

在選定的HPLC MS/MS測定條件下，雞可食組織的相對回收率見表3。

由表 3可知， 生雞蛋在 0.05、0.20、0.50 μg/g添加水平時，分別是 78.86±2.87，83.26±2.72，87.12±2.15，回收率水平依次為生雞蛋，生雞肌肉，半熟雞肉，雞肉最低分別為 73.76±3.53，74.60±3.45，78.56±2.84。

表3 雞可食組織中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 3 Chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

2.3.2 穩定性實驗

日內和日間的變異系數（RSD）見表4、表5。

表4 日間雞可食組織中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 4 Within-day chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

表5 雞可食組織中日內和日間變異系數（n=5，%）Table 5 Chicken edible tissues within-day and between-day coefficient of variation（n=5， %）

由表知，生雞蛋和生雞肌肉的日間變異系數均大于日內的變異系數，而半熟雞肉的日間與日內變異系數無規律；此外隨著藥物濃度的增加，各組織的變異系數普遍存在逐漸變小的趨勢，表明穩定性與藥物濃度存在正相關關系。

3 結論

本研究所得HPLC-MS/MS法檢測阿奇霉素的主要色譜條件為：XDB-C18色譜柱（1.8 μm，2.1×30 mm）；以0.1%甲酸的水和甲醇（60∶40，體積比）作為流動相；流量為0.4mL/min；以MRM掃描模式，母離子m/z 749.5，定量離子m/z 589.5，定性離子m/z 157.8進行檢測。確定0.001μg/mL的標準濃度為最低檢測限（LOD），阿奇霉素組織在添加濃度為0.04 μg/g～0.80 μg/g 與0.80 μg/g～4.0 μg/g（相當于加標后進樣濃度0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 與 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL）范圍時，濃度與峰面積呈線性相關。采用本法測定雞可食組織中阿奇霉素回收率在73.6%以上，日內日間變異系數均小于5%。結果還表明肉雞可食組織中添加藥物濃度越高，變異系數越小，穩定性越好。本方法前處理簡單，出峰時間短，簡單快速，檢出限低，符合動物性食品中阿奇霉素殘留量監控的需求。