大理野生橄欖多糖、總黃酮和總多酚的含量測(cè)定

羅永會(huì)，張翠香，徐春萍

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

大理野生橄欖屬滇橄欖（Phyllanthus emblica L.），是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）植物余甘子（Phyllanthus emblica L.）的果實(shí)。在大理野生橄欖果實(shí)以常生食或鹽漬后食用，入口酸甜微澀，回味甘甜，故名余甘，又名喉甘子，庵羅果，牛甘果等。余甘子含有豐富的多糖及維生素、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）及多酚類(lèi)物質(zhì)等活性物質(zhì)和人體必需的微量元素等[1]。橄欖藥用價(jià)值豐富，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有清熱涼血、消食健胃和生津止咳、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)心血管功能、治療慢性前列腺炎、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、護(hù)肝、抗炎、抗過(guò)敏、抑菌、抗病毒等功效[2]。主要用于治療發(fā)熱咳嗽、煩熱口干、消化不良、慢性肝炎、肥胖、高脂血癥，是衛(wèi)生部公布的“藥食同源”品種之一，也是聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織指定為世界推廣種植的3 種保健植物之一[3-6]。本文以大理豐富的野生橄欖為原料，通過(guò)實(shí)驗(yàn)提取并測(cè)定大理野生橄欖果實(shí)中的可溶性多糖、黃酮及多酚類(lèi)化合物的含量，以期為大理野生橄欖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器和材料

1．1 材料和試劑

新鮮野生橄欖購(gòu)于云南大理市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，產(chǎn)于云南省大理蒼山。

蘆丁（國(guó)藥集團(tuán)）、葡萄糖、沒(méi)食子酸、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚（洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠生產(chǎn)），均為分析純。

1.2 主要儀器

BT-224S 型電子分析天：德國(guó)賽多利斯儀器公司；HH－4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；TDL－4A 低速離心機(jī)：上海菲恰爾儀器有限公司；722E分光光度計(jì)：上海分析儀器有限公司；RA－6000 旋轉(zhuǎn)蒸了儀：上海亞榮生化儀器廠；中藥粉碎機(jī)。

2 方法

2.1 樣品處理

野生橄欖洗凈，去核，60 ℃干燥24 h，粉碎。稱(chēng)取100 g 野生橄欖粉，加入10 倍體積的石油醚，65 ℃水浴回流2 h，重復(fù)2 次，脫脂及去除色素，室溫?fù)]干有機(jī)溶劑，干燥得脫脂野生橄欖樣品，備用。

2.2 待測(cè)樣品的制備

精確稱(chēng)取0.500 g 脫脂橄欖樣品置于250 mL 三角燒瓶中，加入100 mL 去離子水或60%乙醇，用保鮮膜封緊瓶口，置于沸水浴或置于40 ℃水浴（加入60%乙醇則置于40 ℃水浴）浸提2 h～3 h，過(guò)濾，重復(fù)1 次，合并濾液得待測(cè)樣品溶液。

2.3 大理野生橄欖多糖的測(cè)定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖105℃干燥至恒重，稱(chēng)取10.0 mg，用去離子水定容至100.0 mL，則葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1mg/mL。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別加水至2.0 mL，各加1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，再加5.0 mL 濃硫酸，放置5 min，置于沸水浴中加熱15 min，冷至室溫，以第1 管為空白，于490 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

2.3.2 樣品中多糖的測(cè)定

取1.0 mL 待測(cè)樣品，參照2.3.1 方法操作測(cè)定490 nm 處吸光度，代入線性回歸方程，求出樣品多糖的濃度，計(jì)算橄欖中多糖含量：

式中：C 為樣品中多糖的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質(zhì)量。

2.4 野生橄欖總黃酮的測(cè)定

2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱(chēng)取120 ℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品52.8 mg，用60%乙醇定容至100 mL，則蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為0.528 mg/mL 準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分別加60%乙醇至2.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6min 后加5%的氫氧化鈉溶液2.0 mL，混勻，放置15 min 加60%乙醇至10.0 mL，以第1 管為空白對(duì)照，于510 nm 處讀取吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

2.4.2 樣品中總黃酮的測(cè)定

精密吸取1.0 mL 待測(cè)樣品參照2.4.1 方法，配制樣品液，于510 nm 處讀取吸光度，代入線性回歸方程，救出樣品黃酮濃度，計(jì)算橄欖中總黃酮的含量：

式中：C 為樣品中黃酮的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質(zhì)量。

2.5 野生橄欖總多酚的測(cè)定

2.5.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱(chēng)取10.00 mg 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水定容至100 mL，則沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 mg/mL。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.7、1.4、2.1、2.8、3.5 mL，分別加去離子水至5.0 mL，混勻，加入3.0 mL 酒石酸鐵溶液，加磷酸緩沖液至10.0 mL 混勻，以第1 管為空白對(duì)照，于540 nm 處讀取吸光度，以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

2.5.2 橄欖總多酚的測(cè)定

精密吸取1.0 mL 待測(cè)樣品參照2.5.1 方法，配制樣品液，于540 nm 處讀取吸光度，代入線性回歸方程，救出樣品多酚濃度，計(jì)算橄欖中總多酚的含量：

式中：C 為樣品中多酚的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出；V 為樣品稀釋后的體積；m 為樣品的質(zhì)量。

3 結(jié)果分析

3.1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

用苯酚－硫酸法測(cè)定吸光度，并以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.014 6x+0.039 4（R2=0.998 2），葡萄糖濃度在：20 μg～100μg 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)線（490 nm）Fig.1 Standard curve of glucose（490 nm）

3.1.2 蘆丁對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用NaNO2-AINO3-NaOH 法測(cè)定吸光度，并以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.010 8x+0.005 9（R2=0.999 8），蘆丁濃度在：20 μg～105 μg 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系如圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線（510 nm）Fig.2 Standard curre of rntin（510 nm）

3.1.3 焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用灑石亞鐵法測(cè)定吸光度，并以焦性沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.016 6x+0.017 6（R2=0.998 5），焦性沒(méi)食子酸濃度在：14 μg～70 μg 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好線性關(guān)系如圖3。

圖3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)線（540 nm）Fig.3 Standard curre of pyrogallic acid（540 nm）

3.2 大理野生橄欖中多糖及總黃酮和總多酚含量

本實(shí)驗(yàn)分別用去離子水沸水浴和60%乙醇40 ℃水浴浸提2 h～3h，以葡萄糖、蘆丁及焦性沒(méi)食子酸作為對(duì)照品，分別采用苯酚－硫酸法，NaNO2-AlNO3-NaOH 法，灑石亞鐵法測(cè)定大理野生橄欖中多糖、總黃酮及總多酚的含量如表1。

表1 大理野生橄欖中多糖及總黃酮和總多酚的含量（n=5）Table 1 Content of the soluble polysaccharide，flavone and polyphenol in Dali in the wild olive（n=5）

由表1 得大理野生橄欖中含有豐富的多酚、多糖及黃酮類(lèi)物質(zhì)，用60%乙醇浸提總含量可達(dá)（8.98±0.133）%，而用去離子水浸提總含量高達(dá)（8.98±0.13）%，其中多酚含量較高，用60 %乙醇浸提高達(dá)（5.43±0.232）%，而用去離子水浸提也可達(dá)（5.19±0.114）%以上，見(jiàn)圖4。

圖4 橄欖多糖、總黃酮、總多酚的含量與浸提劑的關(guān)系圖Fig.4 The content of total polyphenolsolive polysaccharide total fcavonoids and leaching agent relationship

4 討論

本實(shí)驗(yàn)分別以葡萄糖、蘆丁和焦性沒(méi)食子酸為對(duì)照品用苯酚-硫酸法、NaNO2-AlNO3-NaOH 法，灑石亞鐵法分別測(cè)定大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚的含量，方法快捷、簡(jiǎn)單，穩(wěn)定并且在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。用去離子水沸水浴浸提測(cè)得大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚含量分別為：（3.02±0.105）%、（0.78±0.081）%、（5.19±0.114）%；而用60%乙醇40 ℃水浴浸提測(cè)得大理野生橄欖中多糖，總黃酮和總多酚含量分別為：（2.38±0.675）%、（0.58±0.074）%、（5.43±0.232）%。結(jié)果表明大理野生橄欖含有豐富的抗氧化成分多糖、黃酮和多酚類(lèi)物質(zhì)，是一種藥食同源的綠色食品。且多糖和黃酮的提取用水優(yōu)于用乙醇，而總多酚的提取用乙醇較好。 有關(guān)大理野生橄欖多糖、黃酮及總多酚的提取及生物活性有待進(jìn)一步研究。

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