銀合歡葉黃酮的提取工藝

姜建輝，趙儉波，王貴云

（塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

銀合歡為豆科（Leguminosae）含羞草亞科（Mimosoideae）銀合歡屬（Leucaena Bentham）多年生灌木或喬木，原產美洲，現廣泛分布于世界熱帶亞熱帶地區[1]，目前，我國栽培利用的主要品種是銀合歡[L.leucocephala（Lamarck）de Wit]，該品種適應性強、速生高產、營養價值高、適口性好、易于栽培。合歡葉有安神解郁、活血消腫、用于心神不安、憂郁失眠、癰瘡腫毒、筋骨折傷，還具有吸收空氣中硫氧化物的作用，因而它能夠凈化空氣、美化環境，是調節人們精神生活的優良樹種[2]。銀合歡葉含有黃酮、生物堿、揮發油等多種化學成分[3]。李學堅等進行了銀合歡葉提取物對實驗動物的降血糖效果的研究，可望使銀合歡葉成為開發降血糖藥物的資源[4]。近年來，銀合歡葉資源化利用研究漸成熱點[4-6]，但鮮見測定銀合歡葉黃酮含量的報道。

黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物中，大部分具有較強的抗氧化活性，能起到廣譜抑菌、消炎和抗毒素的作用[7]。植物中黃酮化合物以其純天然、高活性、見效快等特點得到國內外科研人員的極大關注，目前已開發了多種藥用植物黃酮產品。因此，研究從銀合歡葉中提取黃酮類化合物對銀合歡的開發利用具有重要意義。論文對銀合歡葉的黃酮提取工藝進行了探索和優化，從溶劑的濃度、提取時間、提取溫度和料液比的單因素實驗，以及正交實驗進行考察研究，找到銀合歡葉黃酮提取的最優工藝，為銀合歡葉黃酮的工業化生產提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DF-101S 集熱磁力加熱攪拌器：金壇市醫療儀器廠；SHB-Ⅲ循環式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；電子天平：上海菁海儀器有限公司；SENCORW2-180SP：上海申生科技有限公司；722N 可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；KQ3200DE 型數控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；KQ-C 玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市予華儀器有限責任公司；SK1517電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；標準檢驗篩：上虞市儀器設備廠。

銀合歡葉樣品于2012年10月中旬采自新疆阿拉爾塔里木大學校園，銀合歡葉采集后清洗干凈、晾干、粉碎并過40 目篩，收集備用。蘆丁對照品（生物純純度≥95%，上海藍季科技發展有限公司）；無水乙醇、硝酸鋁、氯仿（均為分析純）、亞硝酸鈉（化學純）、蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取60 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品20.0 mg，用30%的乙醇定容于100 mL 容量瓶中，制成濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。

1.2.1.2 工藝流程

銀合歡葉粉末→醇提（兩次）→合并濾液→過濾→濃縮→少量水分散，氯仿萃取（除去葉綠素等脂溶性雜質）→過濾→濃縮→30%乙醇溶解→過濾并定容→測定。

1.2.1.3 樣品溶液的制備

稱取銀合歡樹葉粉末1.00 g，置于250 mL 圓底燒瓶中，按“1.2.1.1”方法在一定的乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比條件下進行提取，濾液過濾定容于25 mL 容量瓶中，即得。

1.2.2 測定波長的選擇

精密量取“1.2.1.1”項下對照品溶液4.00 mL 于25 mL容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7mL 搖勻，放置6min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在400 nm～750 nm 處掃描，結果對照品溶液在508 nm 處具有最大吸收。

1.2.3 標準曲線的繪制[8]

精密量取“1.2.1.1”項下對照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 于25 mL 容量瓶中，加30%乙醇至10 mL，加入5%NaNO20.7 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH 溶液5 mL，再加30 %乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，在508 nm 處，測定吸收度值。以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 樣品溶液的測定

移取“1.2.1.3”項下樣品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，按“1.2.3”方法測定樣品的吸光度，從工作曲線中查出黃酮濃度，由此計算出黃酮得率。

式中：C 為標準曲線上獲得的濃度，（mg/mL）；V0為黃酮初提液定容后的體積，mL；V1為提取液測定時定容后的體積，mL；V2為提取液測定時的體積，mL；W為葉子干粉的質量，g。

圖1 標準曲線圖Table 1 Curve diagram

1.2.5 重復性試驗

為驗證選定的最佳提取工藝的重復性，分別稱取6 份銀合歡葉粉末1.00 g，以最佳提取工藝進行6 次平行試驗，按“1.2.1.3”項下方法制備樣品溶液，移取1.00 mL 于25 mL 容量瓶中，顯色，測定。

1.3 單因素實驗

稱取銀合歡樹葉粉末1.00 g，精密稱量，置于250 mL圓底燒瓶中，在不同條件下提取，考察不同提取時間、乙醇濃度、料液比和提取溫度對銀合歡葉中黃酮提取效果的影響。

1.4 正交實驗

通過單因素試驗對銀合歡葉黃酮的提取條件進行初步研究，，發現各條件對銀合歡葉黃酮的提取率均有一定的影響，選擇L9（34）表安排正交試驗，優化銀合歡葉葉黃酮提取工藝。試驗設計見表1。

表1 銀合歡葉黃酮最佳提取條件正交試驗設計Table 1 Leucaena leucocephala leaf total flavone extraction condition orthogonal test design

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，料液比1 ∶20（g/mL），時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察溫度的影響，結果見圖2。

圖2 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2 Impact of extraction temperature on extraction of flavones

溫度越高，分子運動越劇烈，滲透、擴散、溶解速度越快。同時，高溫可以引起細胞膜結構的變化，使黃酮類化合物更容易被萃取到溶劑中。因此，隨著提取溫度的升高，黃酮得率隨之增加，在35 ℃時黃酮提取率最高。當溫度超過35 ℃時，黃酮得率有所下降。可能是因為水溶性黃酮可能發生水解導致提取率下降，因此，提取溫度選擇35 ℃左右為宜。

2.1.2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

在物料粒度40 目，超聲功率150 W，料液比1∶20（g/mL），溫度35 ℃，時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察乙醇濃度的影響，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction of flavones

由結果如圖3 可知，隨乙醇濃度的增加，黃酮提取率增大，當濃度達到60%時提取率最大，隨著乙醇濃度繼續增加，提取率則開始下降，這可能是乙醇濃度不同，極性也不同，60%乙醇的極性與銀合歡葉的黃酮類化合物極性相近，當乙醇濃度超過60%時，一些脂溶性的物質溶出增加，影響了黃酮類物質的浸出，因此黃酮得率減少。故宜選用60%乙醇為提取溶劑。

2.1.3 料液比對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，溫度35 ℃，時間20 min，提取兩次。以提取率為評價指標，考察料液比的影響，結果見圖4。

圖4 料液比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction of flavones

結果如圖4 可知，在1 ∶25（g/mL）時提取率最大。隨著溶劑量增加，黃酮的溶出量變大。當黃酮充分溶出后，即使繼續加大溶劑量，黃酮的含量基本趨于穩定，而溶劑的及能源的成本相對較高。因此，本實驗確定最佳料液比為1 ∶25（g/mL）。

2.1.4 提取時間對黃酮提取率的影響

以60%乙醇為提取溶劑，在物料粒度40 目，超聲功率150 W，溫度35 ℃，料液比1 ∶25（g/mL）提取兩次。以提取率為評價指標，考察提取時間的影響，結果見圖5。

圖5 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction of flavones

結果如圖5 可知，提取20 min 時得率最高，超過了20 min 后，黃酮得率反而下降，可能是超聲時間過長，提取過程中雜質含量增加，致使有效成分下降[14]。故確定最佳提取時間為20 min。

2.2.1 銀合歡葉葉黃酮最佳提取條件正交試驗結果

鑒于乙醇濃度、提取時間、料液比、對銀合歡葉黃酮的提取均有一定的影響，通過正交試驗確定最佳提取條件，結果見表2。

表2 黃酮提取正交試驗結果Table 2 The results of the orthogonal experiment

由表2 可知，各因素對銀合歡葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為：乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間，極差分析結果表明，A1B1C2D3組合的提取率最高。最終確定銀合歡葉黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度為50%、料液比為1 ∶25（g/mL）、提取溫度為35 ℃、提取時間為15 min。

2.2.2 最佳條件的驗證試驗

按照上述確定的最佳試驗條件A1B1C2D3，重復進行3 次試驗，黃酮提取率分別為2.072 % 、2.054 %、2.066%，平均為2.064%。

2.2.3 重復性試驗

按選定的A1B1C2D3條件進行6 次平行試驗，結果見表3。結果RSD 為1.04%（n=6），用此工藝提取銀合歡葉中黃酮，重復性良好。

表3 重復性試驗測定結果Table 3 Results in repeated test

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗表明，影響黃酮提取率的因素主次順序為乙醇濃度＞料液比＞提取溫度＞提取時間，優化了銀合歡葉中黃酮提取的工藝條件，初步篩選出提取黃酮的最佳工藝組合為A1B1C2D3。得出最佳提取工藝條件為：乙醇濃度50%，料液比1 ∶25，提取時間20 min，提取溫度40 ℃，超聲波輔助提取以其節省時間，易于控制等優點將逐漸代替傳統提取方法。

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[5] 王恩舉,梁德華,楊智蘊.銀合歡葉黃酮類成分的研究[J].海南師范大學學報,2008,21(2):171-172

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