草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的制備及分析

鉏曉艷，熊光權(quán)，李新，耿勝榮，于巍，江洪有，廖濤

（湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)中心，湖北武漢430064）

我國(guó)是世界上最大的淡水魚(yú)養(yǎng)殖國(guó)，隨著淡水魚(yú)類(lèi)加工業(yè)的快速發(fā)展，加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的廢棄物，如魚(yú)鱗。通常魚(yú)鱗加工利用程度很低，絕大部分被直接丟棄，不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，而且造成了資源的浪費(fèi)。其實(shí)，魚(yú)鱗富含膠原蛋白，從中提取膠原蛋白肽不僅能夠充分利用資源，提高魚(yú)類(lèi)加工的附加值，而且可以減少環(huán)境污染，對(duì)促進(jìn)魚(yú)類(lèi)加工業(yè)的良性發(fā)展具有重要意義。

膠原蛋白，是結(jié)締組織中極其重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%[1]。膠原蛋白分子量很大需經(jīng)過(guò)生物技術(shù)降解至分子量到500 D～2500D 范圍，人體才能有效吸收[2]。目前，國(guó)內(nèi)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的開(kāi)發(fā)尚處于起步階段，相關(guān)研究主要集中在膠原蛋白肽的提取工藝和提取方法等方面。膠原蛋白肽的提取和降解，依據(jù)提取介質(zhì)的不同可以分為3 種：即熱水提取[3-4]、酸法提取[5]、堿法提取[6]等。此外，還有酸、堿結(jié)合熱水提取等。上述方法普遍存在提取周期長(zhǎng)，提取率不高，以及酸、堿等廢液排放對(duì)環(huán)境造成影響等問(wèn)題。因此，本研究旨在利用淡水魚(yú)副產(chǎn)品-魚(yú)鱗，通過(guò)優(yōu)化酶解提取過(guò)程，減少酸堿使用量，制備小分子膠原蛋白肽產(chǎn)品，并獲得其相關(guān)性狀指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

草魚(yú)魚(yú)鱗由武漢市武商量販提供。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶（sigma 分裝，酶活0.1 kat/g），蛋白質(zhì)標(biāo)樣（分子量為10 ku～100 ku）購(gòu)自德國(guó)Thermo Scientific公司，其他試劑為國(guó)藥分析純。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

微量移液器：德國(guó)eppendorf；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳槽、DYY-6C 穩(wěn)壓穩(wěn)流電源：北京六一；氨基酸自動(dòng)分析儀：日立L-8800；2695 型凝膠滲透色譜儀：美國(guó)waters。

1.2 方法

1.2.1 魚(yú)鱗膠原蛋白肽的提取工藝

草魚(yú)魚(yú)鱗→清洗陰干→脫雜蛋白→脫鈣→酶解→脫腥脫苦→分級(jí)納濾→冷凍干燥→膠原蛋白肽干粉

1.2.2 草魚(yú)魚(yú)鱗的脫鈣與羥脯氨酸溶出率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g 脫雜清洗烘干的魚(yú)鱗于250 mL 錐形瓶中，平行3 份，以1 ∶60（g/mL）料液比分別加入0.6 mol/L 醋酸溶液、0.6 mol/L 鹽酸溶液、0.6 mol/L 檸檬酸溶液，放在搖床上25 ℃恒溫脫鈣24 h，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。脫鈣充分后，參考GB-T 5009.92-2003《食品中鈣的測(cè)定》[8]的方法測(cè)定溶液中的鈣含量，并按如下公式計(jì)算脫鈣率：法進(jìn)行計(jì)算。脫鈣充分后，羥脯氨酸按照GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》[9]中的方法進(jìn)行測(cè)定，得到溶液中溶出的羥脯氨酸含量（μg/mL）。

1.2.3 草魚(yú)魚(yú)鱗酶解條件的優(yōu)化

為了獲得酶解最佳條件，我們?cè)O(shè)計(jì)了5 因素4 水平的正交試驗(yàn)。分別為酶解溫度（℃）50、55、60、65；酶添加量（%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）2、4、6、8；酶解時(shí)間（h）1、2、3、4；pH5、5.5、6、6.5；料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40。取2 g魚(yú)鱗，按表1 進(jìn)行處理。得到的酶解液根據(jù)甲醛滴定法[10]進(jìn)行水解度的測(cè)定。

1.2.4 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的分子量測(cè)定

我們采用Tricine-SDS-PAGE 凝膠電泳法[11-12]，對(duì)得到的膠原蛋白肽的分子量范圍進(jìn)行測(cè)定。采用垂直板式電泳槽，12%的分離膠與4%濃縮膠，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加樣量為10 μL，待測(cè)樣加樣量為20 μL。先在60 mV的電壓下電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，再將電壓調(diào)整至100 mV 左右，當(dāng)溴酚蘭指示帶接近膠底1 cm 時(shí)，停止電泳。小心將凝膠取下，用5%戊二醛固定1 h，置于染色容器中染色5 h～6 h，再用脫色液脫色1 h。

為進(jìn)一步明確其分子量，我們用凝膠滲透色譜法[13]具體測(cè)定了獲得的膠原蛋白肽的分子量。配制1 000 mL的0.1 mol/L 磷酸氫二鈉溶液，其中含8 g 疊氮化鈉，用磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)pH 至8.0，取500 mL 作為儲(chǔ)備液。另取500 mL 儲(chǔ)備液稀釋至2 000 mL 作為淋洗液。進(jìn)樣量為100 μL，溶劑為水-0.2M 硝酸鈉，淋洗液流速為0.6 mL/min。標(biāo)樣為聚乙烯乙二醇，柱子溫度40 ℃，檢測(cè)器溫度40 ℃。

1.2.5 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽氨基酸測(cè)定

根據(jù)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[14]方法進(jìn)行魚(yú)鱗膠原蛋白肽的前處理，自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定其水解氨基酸種類(lèi)及含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試劑對(duì)魚(yú)鱗脫鈣效果及羥脯氨酸溶出率的影響

不同試劑對(duì)魚(yú)鱗脫鈣效果及羥脯氨酸溶出率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同試劑處理魚(yú)鱗的脫鈣率及羥脯氨酸溶出率Fig.1 Effect of different reagents on decalcification rate and hydroxyproline dissolution rate of fish scales

由圖1 結(jié)果可知，3 種酸比較，鹽酸脫鈣效果最好，檸檬酸次之，醋酸再次之。但是此結(jié)果與EDTA 二鈉的脫鈣結(jié)果相比，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。醋酸和檸檬酸的脫鈣效果較差，不適合工業(yè)生產(chǎn)。另一方發(fā)面，羥脯氨酸是魚(yú)鱗膠原蛋白肽中的特征氨基酸，它在上清液中的濃度表征膠原蛋白的溶出及損失。圖1 結(jié)果顯示，檸檬酸處理魚(yú)鱗后，上清液中羥脯氨酸濃度最高，即膠原蛋白損失最多。醋酸處理的魚(yú)鱗雖然溶液中羥脯氨酸濃度較低，膠原蛋白損失較少，但其脫鈣效果差，所以不適用于生產(chǎn)。就實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，使用EDTA 二鈉處理魚(yú)鱗，不但脫鈣效果最好，且上清液種羥脯氨酸濃度較低，說(shuō)明處理過(guò)程中膠原蛋白損失較少，是較好的脫鈣試劑。

2.2 草魚(yú)魚(yú)鱗酶解條件的優(yōu)化（5 因素4 水平正交試驗(yàn)）

草魚(yú)魚(yú)鱗酶解條件優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 酶解正交試驗(yàn)L16（54）及結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment L16（54）of enzymolysis and results

根據(jù)表1 水解度和K 值結(jié)果，酶解溫度60 ℃、酶添加量8%、酶解時(shí)間2 h、pH 5.0、料液比1 ∶30（g/mL）時(shí)，水解度最高。R 值結(jié)果顯示，酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比是影響酶解效果的主要因素，酶添加量和pH為次要因素。此外，對(duì)水解度較高的三組數(shù)據(jù)進(jìn)行了t-test 成對(duì)檢驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)15 的處理結(jié)果與優(yōu)于實(shí)驗(yàn)10 的處理結(jié)果，差異顯著（p＜0.05）。實(shí)驗(yàn)12 的處理結(jié)果雖然平均值較高，但與實(shí)驗(yàn)15 和實(shí)驗(yàn)10 的結(jié)果相比，無(wú)顯著性差異，可能由于其本身結(jié)果偏差較大的緣故。

2.3 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽分子量的測(cè)定

膠原蛋白肽分子量結(jié)果見(jiàn)圖2～圖3 和表2。

圖2 正交試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)9-15 所得酶解液的Tricine-SDS-Page電泳結(jié)果Fig.2 Tricine-SDS-Page electrophoresis results of enzymatic hydrolyzates of test 9-15 in Orthogonal experiment L16（54）

圖3 凝膠滲透色譜的測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results from Gel permeation chromatography measurement

表2 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的分子量結(jié)果Table 2 Molecular weight of fish scale collagen peptide from Grass carp

我們對(duì)正交實(shí)驗(yàn)（表1）中所得到的膠原蛋白肽進(jìn)行了Tricine-SDS-Page 電泳，其中實(shí)驗(yàn)9-16 的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，有基團(tuán)較小的蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)（圖2 箭頭處），其分子量遠(yuǎn)低于10 ku。為了進(jìn)一步明確這個(gè)蛋白質(zhì)基團(tuán)的分子量，我們用凝膠滲透色譜進(jìn)行具了體測(cè)定，表2 結(jié)果顯示，酶解后粉末中主要是這種小分子蛋白，分散度小、分子量均一，其峰值分子量和數(shù)勻分子量均低于500 u。圖3（橫坐標(biāo)為出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)為電信號(hào)值表征出峰強(qiáng)度）結(jié)果顯示，膠原蛋白肽出峰良好，峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾和鼓包現(xiàn)象，主要分子量集中在454 u。

2.4 草魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白肽的氨基酸分析

為了弄清魚(yú)鱗膠原蛋白肽的氨基酸組成，我們進(jìn)行了水解氨基酸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 草魚(yú)魚(yú)鱗及其膠原蛋白肽的氨基酸含量及比例Table 3 Amino acid content and proportion of Grass carp fish scale and its collagen peptide

表3 顯示，魚(yú)鱗膠原蛋白肽中甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、精氨酸、天冬氨酸的含量較高。除了酪氨酸和胱氨酸的含量較低外，其余16 中氨基酸均超過(guò)膠原蛋白肽總重的1%，共占氨基酸含量的99.07%。草魚(yú)魚(yú)鱗中氨基酸的含量占魚(yú)鱗總重的31.19%，其中甘氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸，精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸的含量較高，均超過(guò)魚(yú)鱗總重的1 %，占魚(yú)鱗氨基酸總含量的83.44%。

3 討論與結(jié)論

由于酸堿脫鈣處理會(huì)造成環(huán)境負(fù)擔(dān)，因此本研究采用EDTA 二鈉處理魚(yú)鱗。EDTA 二鈉是優(yōu)良的絡(luò)合劑（螯合劑），可以有效螯合多種金屬離子（如，鈣、鎂、鐵、鉛、銅、錳等）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于酸處理來(lái)說(shuō)，EDTA 二鈉不但能高效脫鈣還能減少魚(yú)鱗膠原蛋白肽的特征氨基酸-羥脯氨酸的溶出率，是魚(yú)鱗脫鈣前處理的較理想試劑。

在酶種類(lèi)的選擇上，本研究前期結(jié)果顯示，胃蛋白酶由于作用pH 較低，導(dǎo)致制備的膠原蛋白肽酸苦味重，后處理困難。因此本研究以木瓜蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶，優(yōu)化酶解條件，將人體難以消化吸收的魚(yú)鱗膠原蛋白定向剪切成小分子活性肽。結(jié)果表明，最佳酶解條件為：酶解溫度60 ℃、酶添加量8%、酶解時(shí)間2 h、pH 5.0、料液比1 ∶30（g/mL）。獲得的膠原蛋白肽分子量均一，分散度小，平均分子量在500 u 左右。魚(yú)鱗經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后，氨基酸絕對(duì)含量上升，但組成變化不大，其中主要含有甘氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸等。

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