非諾貝特保護非酒精性脂肪性肝病小鼠胰島素抵抗作用機制的探討

沈馨茹，魯云霞，章 秋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指以除外酒精或其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年上升，已成為最常見的慢性肝臟疾病［1］。NAFLD除了可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌和移植肝復發(fā)外，還可影響其他慢性肝病的進展，并參與2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發(fā)病過程［2］。NAFLD的重要病理學特征之一是胰島素抵抗［3］，近年來文獻［4］報道其可能與內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關。非諾貝特是目前臨床上較為常用的調脂藥物，其作用機制可能與降脂、抗炎和抗氧化應激等有關，但尚無其參與ERS的相關報道［5］。由于非諾貝特的藥效學效應較明確，該研究先用模擬人類高熱量高膽固醇飲食(high-calorie and high-cholesterol diet，HCD)的比例制作的飼料誘導構建NAFLD小鼠模型，然后給予單一劑量的非諾貝特干預，初步探討其保護作用是否與改變過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-acivated receptor α，PPARα)以及ERS標志蛋白葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)和轉錄因子GADD153(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)的表達有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡C57BL/6小鼠36只，清潔級，雄性，體重20～25 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，每籠6只，溫度20～25℃，相對濕度35% ～60%，自由攝食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)1周后實驗。

1.2 主要試劑 非諾貝特(江蘇神龍藥業(yè)有限公司);油紅 O(美國 Sigma公司);RNAiso Reagent、Real-time PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);RT試劑盒(美國Fermentas公司);BCA蛋白定量試劑盒(上海生工生物工程有限公司);3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體(康為世紀生物技術有限公司);兔抗鼠 PPARα、CHOP一抗(美國 Santa Cruz公司);兔抗鼠 GRP78一抗(美國 Abcam公司);山羊抗兔及山羊抗鼠辣根過氧化物酶抗體(武漢博士德生物技術有限公司);ECL增強型發(fā)光劑(美國Pierce公司);RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)。

1.3 造模與分組 將C57BL/6小鼠隨機分為正常飲食組(SCD組，n=10)和HCD組(n=26)，SCD組給予標準飼料喂養(yǎng)(安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，總熱量14.5 kJ/g，含66.9%碳水化合物，24.8%蛋白質，8.3%脂肪);HCD組給予高熱量高膽固醇飼料喂養(yǎng)(由20%豬油，20%蔗糖，10%蛋黃粉，1%膽固醇和49%基礎飼料混合壓制成型)，12周后取體重明顯增加的小鼠20只隨機分為HCD組(n=10)和HCD+非諾貝特組(HCF組，n=10)，HCD組繼續(xù)予以HCD喂養(yǎng)2周，HCF組在給予HCD的同時予以非諾貝特40 mg/(kg·d)灌胃治療2周。

1.4 葡萄糖耐量試驗(GTT)和胰島素耐量試驗(ITT) 小鼠禁食12 h后，灌胃給予葡萄糖2 g/kg，分別于0、30、60、90、120 min 鼠尾采血測定血糖水平，行GTT;小鼠禁食4 h后，腹腔注射胰島素0.1 U/kg，分別于 0、30、60、90、120 min 采血測定血糖值，行ITT。采血量約5 μl，采血過程中小鼠生命體征平穩(wěn)。

1.5 血清學檢測 所有小鼠禁食12 h，CO2窒息處死，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，分離血清，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartic transaminase，AST)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)水平。

1.6 HE和油紅O染色 將肝組織經4%多聚甲醛固定后進行石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，200倍光鏡下觀察并采集圖像。將肝組織進行冰凍切片，厚約5 μm，60%異丙醇中稍洗，油紅O染色約1 h，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木精染核，甘油明膠封片，400倍光鏡下觀察并采集圖像。

1.7 實時熒光定量PCR TRIzol法抽提肝臟組織總RNA，2 μg總RNA經逆轉錄合成cDNA第一鏈，采用Primer 5.0軟件設計引物。PPARα上游:5'-ACGATGCTGTCCTCCTTGATG-3'，下 游:5'-GTGTGATAAAGCCATTGCCGT-3';GRP78上游:5'-TGTGGTACCCACCAAGAAGTC-3'，下游:5'-TTCAGCTGTCACTCGGAGAAT-3';CHOP上游:5'-ATATCTCATCCCCAGGAAACG-3'，下游:5'-TCTTCCTTGCTCTTCCTCCTC-3';GAPDH上游:5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'。在StepOnePlus(美國ABI公司)上進行擴增，94℃預變性4 min，94 ℃變性15 s，60 ℃ 40 s，共40個循環(huán)，用比較Ct法(ΔΔCt法)分析結果。

1.8 Western blot 各組肝臟組織50 mg，RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA法測蛋白濃度，12%SDSPAGE凝膠電泳，轉移到PVDF膜上，封閉后分別用抗 GAPDH(1 ∶800)、PPARα (1 ∶800)、GRP78(1∶600)和CHOP(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光劑反應5～10 min，暗室顯影成像，實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 非諾貝特對NAFLD小鼠胰島素抵抗的影響GTT結果表明:HCD組小鼠空腹血糖值比SCD和HCF組高，注射葡萄糖30 min后血糖達到峰值，且明顯高于SCD和HCF組，此后下降緩慢，血糖波動大;與HCD組相比，HCF組血糖波動較平穩(wěn)，且峰值明顯低于HCD組。ITT結果表明:在注射胰島素30 min內，SCD組小鼠血糖迅速下降，隨后緩慢上升，HCD組血糖下降緩慢，且始終維持在較高水平;HCF組各時間點的血糖值介于SCD和HCD組之間，見圖1。

表1 3組小鼠的血液生化指標變化(n=10，±s)

表1 3組小鼠的血液生化指標變化(n=10，±s)

與SCD組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與HCD組比較:#P＜0.05

SCD 0.44 ±0.07 1.67 ±0.29 1.78 ±0.39 0.21 ±0.0539.20 ±5.71 68.40 ±10.14 HCD 0.73 ±0.14＊＊ 2.42 ±0.45＊＊ 1.29 ±0.26＊＊ 0.49 ±0.09* 40.14 ±8.19 68.00 ±18.58 HCF 0.44 ±0.12# 2.21 ±0.25 1.56 ±0.18 0.42 ±0.27 41.14 ±7.38 74.57 ±13.21 F值3.864 7.044 4.148 3.809 0.104 0.412

2.2 非諾貝特對NAFLD小鼠血清生化指標的影響 如表1所示，與SCD組小鼠相比，HCD組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05);與HCD組比較，HCF組中TG下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);ALT和AST水平在3組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 各組小鼠GTT和ITT

2.3 非諾貝特對NAFLD小鼠肝臟組織病理學的影響 SCD組小鼠肝細胞形態(tài)正常，胞質清晰;HCD組可見肝細胞內有大小不等的脂滴形成，肝細胞有氣球樣變，中央靜脈處有炎性細胞浸潤;而HCF組肝細胞脂肪變性程度及炎性細胞浸潤較HCD組明顯減少;油紅O染色同樣表明了HCD組肝細胞內的脂滴明顯多于SCD組，而HCF組肝細胞內脂滴明顯減少。見圖2。

2.4 非諾貝特對PPARα、GRP78和CHOP mRNA水平表達的影響 Real-time PCR結果表明，與SCD組比較，HCD組小鼠肝臟組織內 PPARα、GRP78 mRNA表達量明顯降低，而CHOP mRNA表達量明顯升高(P＜0.05);非諾貝特干預后能夠顯著增加肝臟組織內的PPARα、GRP78 mRNA的表達量，減少CHOP mRNA的表達量(P＜0.05)，見圖3。

2.5 非諾貝特對PPARα、GRP78和CHOP蛋白水平表達的影響 Western blot結果表明，與SCD組相比，HCD組小鼠肝臟組織表達的PPARα、GRP78蛋白水平顯著下降，CHOP的蛋白表達量明顯升高(P＜0.05);非諾貝特干預后PPARα、GRP78的蛋白水平表達顯著上升，CHOP的蛋白表達量明顯下調(P＜0.05)，見圖4。

圖2 各組肝組織病理學情況

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝病，包含了一系列肝臟損傷狀態(tài)，包括單純性脂肪肝(simple steatosis，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其最后的肝硬化和肝纖維化。本次研究采用高熱量高膽固醇飼料喂養(yǎng)小鼠12周，HCD組小鼠血清的TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平明顯下降;病理學檢測顯示HCD組小鼠肝細胞內有大小不等的脂滴形成，肝細胞部分氣球樣變，局部有炎性細胞浸潤，表明已成功建立了NAFLD模型。

圖3 非諾貝特對各組小鼠肝臟組織PPARα、CHOP、GRP78 mRNA表達水平的影響

圖4 非諾貝特對各組小鼠肝臟組織PPARα、GRP78、CHOP蛋白表達水平的影響

非諾貝特是PPARα的特異性激動劑，具有抗氧化應激、抑制炎癥反應、抗凋亡等作用，可降低2型糖尿病血管并發(fā)癥的風險［6－8］。本實驗采用該藥治療時，顯示非諾貝特可明顯降低NAFLD小鼠的血清TG水平，減少肝細胞內的脂滴，表明非諾貝特能夠降低血脂和減輕肝臟脂肪沉積。然而，ALT和AST水平在3組小鼠間的差異無統(tǒng)計學意義，之前曾有文獻［9］報道59%的脂肪肝患者血清ALT是正常的，這些患者肝臟活檢證實還未進展至NASH階段，本次研究結果與其基本一致。

內質網是真核細胞內重要的細胞器，在維持細胞內穩(wěn)態(tài)的平衡方面具有重要作用，當內質網穩(wěn)態(tài)被破壞時，將會導致ERS，而已知ERS在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中扮演相當重要的角色［10］。GRP78是內質網中最重要的分子伴侶之一，可參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉運，研究［11］表明在ERS的早期，GRP78的表達迅速增加，可幫助變性蛋白重新折疊，恢復蛋白質的正確構象，減輕ERS，同時將無法恢復的蛋白質轉移降解，從而避免細胞進一步受到傷害。然而，持續(xù)過強的應激將會使內質網自穩(wěn)態(tài)功能受到嚴重損害，GRP78合成減少，同時CHOP的表達明顯增加，從而啟動細胞內的凋亡通路，使細胞死亡［12］。本研究中非諾貝特能明顯激活PPARα的表達，從而通過增加肝組織中TG的氧化分解來起降脂作用;另一方面通過增加GRP78的表達、降低CHOP的表達來減輕ERS進而激活下游的胰島素信號通路來改善胰島素抵抗;但GRP78 mRNA和蛋白水平的改變不太一致，可能與其轉錄后模板降解增加有關，其具體原因有待后期的進一步深入研究。

本研究結果表明:非諾貝特有明顯的改善NAFLD小鼠的胰島素抵抗、降低TG的作用，可能與激活PPARα及減輕ERS有關。然而非諾貝特具體影響ERS下游的哪條信號通路還需要進一步的實驗來證實，其機制的闡明將為非諾貝特開發(fā)作為治療NAFLD的藥物奠定基礎。

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