乳酸菌的抗凍機制及抗凍能力研究

吳先帆，崔艷華

（哈爾濱工業大學 食品科學與工程學院，哈爾濱150090）

0 引 言

近年來，隨著人們對微生物益生作用的認識日益提高，越來越多的乳酸菌被利用于食品和醫療領域中。不同種類的乳酸菌生長在不同的環境條件下，并且廣泛分布與自然界中。人類和動物體內、奶制品及一些植物的表面都存在這不同類型的乳酸菌。

低溫環境中的乳酸菌在工業生產有著重要的作用，因此研究乳酸菌在低溫環境中的抗凍機制，有助于優化乳酸菌發酵劑和發酵乳制品在工業生產中冷凍、發酵和儲藏條件，然而人們對于低溫環境中的乳酸菌的研究和利用并不充分。本文主要從乳酸菌的生物學特性著手，闡述目前乳酸菌的抗凍機制及其在低溫環境中抗凍能力的測定。

1 乳酸菌的抗凍機制

目前，人們對大腸桿菌的冷凍刺激反應及其適應性已有較為深入的研究，而對乳酸菌這方面的研究卻很少。乳酸菌在冷凍過程中的生理結構主要發生以下變化：（1）低溫環境下，細胞膜的流動性下降；（2）低溫環境下，乳酸菌的DNA和RNA二級結構受到影響，從而影響DNA的復制以及轉錄和翻譯的效率[1]。具體論述如下。

1.1 低溫誘導合成冷誘導蛋白（CIP）

細菌在低溫環境下會發生冷激反應，此時細胞的冷誘導蛋白（Cold-induced protein,CIP）量會增多。冷誘導蛋白的合成主要是通過以下途徑改善細胞對低溫的適應能力，（1）增加短鏈或者不飽和脂肪酸的比例進而改善細胞膜的流動性；（2）通過降低負超螺旋，增加DNA超螺旋；（3）提高轉錄和翻譯的效率。

雙向電泳分析表明，經過冷刺激后，舊金山乳桿菌（Lactobacillus sanfranciscensis） CB1、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 20B、短乳桿菌（Lactobacillus brevis） H12菌株中分別有14個、18個和13個蛋白表達量提高[2]。乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363菌株受到冷刺激后，一些涉及翻譯加工、糖代謝、染色體結構和信號轉導等相關蛋白被誘導[3,4]。Lactococcus piscium CNCM I-4031菌株在受到冷刺激后一些基礎壓力蛋白以及糖酵解、脂肪酸合成、能量代謝相關的蛋白表達發生了明顯變化，其中包括壓力蛋白DbaK、UspA；糖酵解蛋白Fba、GAPDH、Pgk；脂肪酸代謝蛋白FabH、FabF、FabG等等[5]。

冷激蛋白（Cold shock protein,CSP）是重要的冷誘導蛋白，可以作為陪伴分子與RNA通過非特異性相結合，可抑制mRNA二級結構的形成，使低溫環境下的轉錄和翻譯得以正常進行[6]。CSP最早在大腸桿菌中被發現，在乳酸菌各個種中也有所發現[7]，并且乳酸菌不同種及其亞種之間的CSP基因數目不盡相同[8]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）PB18和CNRZ302菌株中分別含有1個和6個CSPs[9,10]。Bolotin等對乳酸乳球菌乳酸亞種IL1403全基因組序列分析表明其含有2個CSP基因:cspD和cspE[11]。而對乳酸乳球菌乳脂亞種MG1363的分析，發現該菌含有2對CSP基因 （cspA-cspB和cspC-cspD）、1個單個基因cspE以及一個cspD2，同時發現適量的CSPC可以促進cspB、cspF和cspG基因的表達[3]。 MG1363中的7個CSP基因[3]與同種的IL1403中的2個基因截然不同。同樣,植物乳桿菌C3.8菌株中含有2個CSP基因（cspL和cspP）[12]，而植物乳桿菌NC8菌株中，除含有上述兩個基因外，還檢測出cspC基因[13]。近來在L.piscium CNCM I-4031菌株中也發現了7 ku的CSP蛋白，但是雙向電泳研究表明該蛋白并非為冷刺激所誘導[5]。因此，應對某些特定菌株進行特定冷誘導蛋白種類和特性的研究。

此外，冷誘導蛋白的數量、種類及誘導效率與菌株處理或存放的溫度和時間也密切相關。20°C下，嗜熱鏈球菌培養2 h和4 h分別合成14個和18個冷誘導蛋白,而在10°C下培養4 h只合成4個冷誘導蛋白[10]。經過轉錄、核酸雜交技術和2-DE分析表明，MG1363的7個CSP蛋白中有5個 （CspA、CspB、CspC、CspD、CspE）可以被誘導，并且在10°C下的誘導效率最高，而在20°C和4°C下誘導效率最低[14]。與乳酸乳球菌相似，植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌都會有相應的最適的誘導溫度。到目前為止，德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌ATCC11842中，僅有1個CSP基因（CspA）被鑒定出。Serror等在42°C下培養德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌時檢測出CspA的轉錄，并發現25°C下其表達達到最大值[15]。低效率的CSPs誘導會使乳酸菌的生長阻滯。因此,即使是同一菌株,其培養溫度的改變也會令其冷誘導蛋白的種類和活性發生改變。在工業生產中，測定CSPs誘導的最適溫度對于優化是十分重要的。

1.2 脂肪酸的變化

低溫對細胞最重要的影響之一，是使細胞膜固有的液態結晶轉變為凝膠態，從而導致細胞膜的流動性下降。在冷凍過程中，乳酸菌細胞膜中的脂肪酸會發生改變，不飽和脂肪酸含量增加，而飽和脂肪酸含量下降。由于不飽和脂肪酸的熔點較低，使得在低溫下仍能夠保持液態，從而在冷凍過程中細胞膜的流動性得以增加。一些脫氫酶類在該變化中起著重要作用，如大腸桿菌中，β-酮酰基酰基載體蛋白合成酶可以將棕櫚油酸轉化為異油酸[16]。研究表明，L.piscium CNCM I-4031菌株在冷刺激和冷馴化后，一些脂肪酸代謝相關的酶表達量發生明顯變化，其中包括β-酮酰基載體蛋白（ACP）合成酶III（FabH），該酶參與II型脂肪酸合成的最初階段；β-酮脂酰ACP合成酶II（FabF）和β-酮脂酰ACP還原酶（FabG），二者參與脂肪酸伸長率。在冷刺激后，FabH合成量上升，FabF表達量下降；FabG在冷馴化后，表達量下降[5]。Béal等研究表明，增加不飽和脂肪酸的含量，會使嗜熱鏈球菌具有較好的抗凍性[17]。此外，一些特異性脂肪酸對于乳酸菌的抗冷凍性也起著重要作用。Murga等對嗜酸乳桿菌進行冷刺激試驗，結果表明C18:2脂肪酸的含量明顯增加[18]。在低溫條件下,植物乳桿菌中C18:1脂肪酸含量同樣有所增加[19]。另外,德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌L2、嗜酸乳桿菌以及瑞士乳桿菌抗凍性能的提高與cycC19:0脂肪酸含量的增加密切相關[20,21]。

環丙烷脂肪酸（Cyclopropane Fatty Acid，CFA）是通過對已整合到磷脂分子的不飽和脂肪酸的后合成修飾形成，即從S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）轉移一個甲基基團到不飽和脂肪酸的雙鍵上，形成環丙烷脂肪酸。研究證實，環丙烷脂肪酸有利于提高德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌和舊金山乳桿菌的抗凍能力[20,22]。Zhang等人對Oenococcus oeni的冷凍干燥研究中發現，環丙烷脂肪酸C19cyc11的形成對保護細胞扮演了重要角色[23]。因此，檢測不同菌株的抗凍能力，可通過測定脂肪酸的含量及其組成成分來確定。

1.3 核糖體狀態的變化

細菌中核糖體對溫度具有敏感性[24]，其狀態會隨著溫度變化而發生改變。隨著溫度的升高，其翻譯的速度會大大升高，而帶有相應氨基酸的tRNA的提供速度卻變化不大，使得核糖體的酰胺基位點空缺。此外，冷刺激使核糖體翻譯的效率變低，而在相應酰胺基位點上，由于氨基酰tRNA濃度的增加受到阻礙，進而降低了(p)ppGpp五磷酸鳥苷（鳥苷5’-三磷酸-3’二磷酸）的濃度。升高溫度有助于(p)ppGpp的集中，而降低溫度則會降低(p)ppGpp的濃度。研究表明，高濃度(p)ppGpp可以降低CSP的表達，而低濃度則會增加CSP的表達[25]。因此，機體對于冷刺激的反應很大程度上受(p)ppGpp的影響。

1.4 核酸的變化

DNA通常為負超螺旋，且易受到溫度的影響。其延伸由DNA促旋酶和DNA拓撲異構酶Ⅰ調控。研究表明，細菌在受到冷刺激之后，DNA負超螺旋迅速增加。DNA超螺旋的調節對DNA的復制、轉錄、重組等功能具有重要作用。一些相關的變化（如堿基對數量的改變）也是由于超螺旋密度的改變而引起的[26]。Mizushima等將大腸桿菌置于6°C低溫水浴中培養，提取不同培養時間大腸桿菌的質粒DNA，并用含磷酸氯喹的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，結果顯示,低溫使細胞中質粒DNA負超螺旋增加，但是該反應是短暫的，60 min內DNA高度超螺旋狀態就會恢復[27]。

2 乳酸菌抗凍能力的測定

乳酸菌抗冷凍能力，即乳酸菌細胞冷凍儲藏于20°C之后恢復其酸化活力的能力。根據乳酸菌抗凍機理，對待選菌株的抗凍能力進行篩選，對工業生產有著重要的意義。

2.1 脂肪酸的測定

可以通過氣相色譜法對乳酸菌細胞膜脂肪酸的含量進行快速測定[28]。Wang等對植物乳桿菌和酒明串珠菌進行了研究，首先提取菌體脂肪酸并進行甲基化，然后利用氣相色譜進行分析，總結出酒明串珠菌中除主要成分C16:0外，還含有C14:0和C18:0等；而植物乳桿菌中細胞膜脂肪酸的主要成分為C18:1ω-7[29]。嗜酸乳桿菌RD758細胞膜中含有13種脂肪酸，氣相色譜分析發現，冷凍后，細菌細胞膜中的脂肪酸種類未發生變化，但是不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例發生了明顯變化。15°C下冷凍8 h后，細菌細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例以及cycC19:0相對百分比的變化影響最大[29]。Montanari等人優化了氣相色譜方法，成功測定了Lactobacillus helveticus和L.sanfranciscensis中環丙烷脂肪酸的含量。二者受到冷刺激后，環丙烷脂肪酸的含量發生明顯變化[22]。

2.2 乳酸脫氫酶的測定

乳酸脫氫酶（LDH）是存在于細胞內參與糖酵解最后一步的一種催化酶。當細胞受損時，LDH會流到培養液中。因此，乳酸菌經過冷凍處理后，可通過測定培養基中LDH的含量，從而得知乳酸菌細胞的受損情況，進而反映出其抗冷凍能力。

通常采用比色法對乳酸脫氫酶進行測定[30]。乳酸與氧化型輔酶Ⅰ（NAD）在LDH催化作用下生成丙酮酸與還原型輔酶Ⅰ（NADH）,丙酮酸再與2，4-二硝基苯肼進行反應生成2，4-二硝基苯腙，而 2，4-二硝基苯腙在堿性溶液中呈棕紅色。因此，可通過比色法測定丙酮酸含量，從而推算出LDH的活力。

2.3 酸化活力的測定

酸化活力即乳酸菌發酵乳糖產酸的能力。乳酸菌酸化活力的測定可以采用pH計直接測定。首先待測菌株接種于脫脂乳培養基中，放置于適當溫度下進行培養。連續測定樣品菌懸液的pH值，直至pH值為5.5時停止，記錄培養時間。樣品菌懸液pH值下降至5.5所需時間越長，則表示菌的酸化活力越弱。檢測冷凍前后酸化活力，通過冷凍后及冷凍前的時間差值，即可看出不同乳酸菌的抗冷凍能力。

3 結束語

低溫環境中的乳酸菌是一類非常有應用價值的資源。目前國內外對于低溫環境中乳酸菌的抗凍機制的研究并不深入。對于低溫環境中的乳酸菌的研究，過去主要集中應用于傳統培養。最近幾年，許多研究者將分子生態學方法應用于低溫乳酸菌的鑒定和分離，使得對這一領域的研究更加深入。隨著人們對低溫乳酸菌抗凍機制認識的逐步深入，相信這類資源會有廣泛的應用前景。

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