系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血Vα24-Vβll自然殺傷T細(xì)胞致病性的研究

關(guān)興麗

自然殺傷T細(xì)胞(NKT)是一個(gè)具有自然殺傷細(xì)胞(NK)受體及功能的T細(xì)胞亞群，其特異性的標(biāo)記是TCRVα24片段，通常和Vβll片段結(jié)合。NKT活化時(shí)主要識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面分化抗原(CD)1d分子提呈的糖脂類抗原，并在活化后迅速釋放大量的γ干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素(IL—4)，這兩種細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)Thl和Th2型應(yīng)答的主要細(xì)胞因子。因此，NKT細(xì)胞除具有非特異性殺傷功能外，還可能是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多發(fā)性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制中免疫調(diào)節(jié)失調(diào)是重要因素，但NKT在其發(fā)病中的作用國內(nèi)外則鮮見報(bào)道，本研究用流式細(xì)胞儀檢測SLE患者NKT細(xì)胞數(shù)量及功能狀況，以了解NKT在SLE發(fā)病中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象：本院住院及門診SLE患者32例，女30例，男2例，年齡16—62歲，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，未合并其他自身免疫疾病、腫瘤、近期感染和組織損傷，在3個(gè)月內(nèi)未用免疫抑制劑。健康志愿者30名，女22名，男8名，年齡21～50歲。均取2ml全血肝素鈉抗凝，立即送檢。

1.2 試劑：CD3PerCP、Anti-INF--γFITC／Anti-IL—4PE、TCRVα24FITC、TCRVα24 PerCP、TCRVβllPE、CD69 PerCP、膜通透劑、紅細(xì)胞裂解液(美國BD公司)，佛波醇酯(PDB)、離子霉素(ionomycin)、Brefeldin(BFA)、莫能菌素(Sigma公司)。RPMI—1640、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及β-巰基乙醇等細(xì)胞培養(yǎng)試劑(GibcoBRL公司)。

1.3 NKT細(xì)胞數(shù)檢測：取肝素鈉抗凝全血50 μl，加入CD3 PerCP、TCRVα24FITC、TCRVβ11PE各10 μl，4℃避光孵育30 min，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，迅速于混旋器上混勻，室溫放置8 min，棄上清液，加PBS 2ml洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加1 000μl PBS混勻后，立即上流式細(xì)胞儀檢狽顫。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及活化：取肝素鈉抗凝全血1 ml，用含10%FBS完全培養(yǎng)液RPMI-1640稀釋到3 ml，分別加入24孔培養(yǎng)板的空白對照孔和含有PDB(2×l0-7moL／L)+Ion(1mg／L)孔，做細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色時(shí)，每孔各加2 μmoL／L蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑BFA和莫能菌素。36.5～37～℃5%CO2中培養(yǎng)6h。

1.5 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：按文獻(xiàn)[5]方法操作。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測：用美國BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀，以三色熒光標(biāo)準(zhǔn)微球，啟動(dòng)FACSCom軟件，使儀器處于最佳工作狀態(tài)。采用cellquest軟件檢測及分析。測定時(shí)各熒光通道均以相應(yīng)同型(isotype)IgC染色細(xì)胞作陰性對照。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析：用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用君檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組NKT含量比較：SLE患者NKT(CD3+TCRVα24+TCRVβll+淋巴細(xì)胞)顯著低于正常對照組(P＜0．01)，見表1。

2.2 兩組NKT細(xì)胞活化前后CD69(TCRVα24+例CD69’CD3’細(xì)胞)表達(dá)比較：SLE患者活化前NKT細(xì)胞CD69表達(dá)顯著低于正常對照組(P＜0.05)。經(jīng)PDB+Ion刺激6h后，NKT細(xì)胞CD69的表達(dá)均明顯高于刺激前，但SLE患者NKT細(xì)胞CD69表達(dá)則顯著低于正常對照組(P＜0.01)，見表2。

表1 兩組NKT細(xì)胞數(shù)量比較(%，±s)

表1 兩組NKT細(xì)胞數(shù)量比較(%，±s)

注：*與正常對照組比較P＜0.01

組別 例數(shù) CD3+ TCRVα24+TCRVβ11+細(xì)胞數(shù)正常對照組 30 1.07±0.23 SLE 32 0.44±0.25*

表2 兩組活化前后TCRVα24+CD69+CD3+細(xì)胞比較(%，±s)

表2 兩組活化前后TCRVα24+CD69+CD3+細(xì)胞比較(%，±s)

注：*活化前后與正常對照組比較，P＜0.05;#活化后與活化前比較，P＜0.01

組別 例數(shù) TURVα24+ CD69+ CD3+活化前 活化后正常對照組 30 11.47±2.86 96.71±0.33#SLE組 32 5.26±2.12* 56.61±0.47#

2.3 兩組活化前后NKT細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子INF-γ和IL4表達(dá)比較：SLE患者活化前NKT細(xì)胞胞漿內(nèi)INF- γ與正常對照組無明顯差異(P＞0．05)，而活化后NKT細(xì)胞胞漿內(nèi)INF-γ顯著低于正常對照組p＜0．05)。而活化前后NKT細(xì)胞胞漿內(nèi)IL-4均顯著高于正常對照組(P＜0．05)，見表3。

表3 兩組活化前后NKT細(xì)胞內(nèi)INF-γ和IL-4表達(dá)比較：(PG/L, ±s)

表3 兩組活化前后NKT細(xì)胞內(nèi)INF-γ和IL-4表達(dá)比較：(PG/L, ±s)

注：*與正常對照組比較，P＜0.05

活化前 活化后INF-γ+ IL-4+ INF-γ+ IL-4+正常對照組 30 8.45±6.29 12.21±3.31 33.65±11.91 26.93±6.84 SLA組 32 7.96±5.91 32.46±5.49*19.32±6.45*48.38±8.53*組別 例數(shù)

3 討 論

研究證實(shí)，不同程度的免疫調(diào)節(jié)失常與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。但是，對這種失調(diào)的確切機(jī)制至今尚無一致的認(rèn)識(shí)。Vα24—VβllNKT細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的新的淋巴細(xì)胞亞群，具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。NKT在抗原刺激下，可分泌大量具免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如IL-4和INF-γ等，從而影響免疫反應(yīng)的類型，使免疫反應(yīng)向Thl型或Th2型轉(zhuǎn)換；同時(shí)NKT還可通過Fas-FasL途徑和分泌穿孔素等直接介導(dǎo)細(xì)胞毒作用。因此，NKT在生物體的多種免疫反應(yīng)，如抗微生物感染，自身免疫疾病的發(fā)生，移植物的存活，抗腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。人類已經(jīng)證實(shí)NKT細(xì)胞數(shù)量下降或功能改變與自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。同卵雙胞胎之間，糖尿病患病個(gè)體與無糖尿病個(gè)體相比，NKT細(xì)胞數(shù)在前者明顯降低。提示NKT的功能低下可使自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能相對亢進(jìn)而致使發(fā)病幾率增加。

人類外周血NKT細(xì)胞數(shù)量少是長期以來限制對其研究的主要原因，本試驗(yàn)以抗人TCRVa24—Vβll單克隆抗體作為特異性標(biāo)記，采用全血裂解紅細(xì)胞分離有核細(xì)胞獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞，利用目前較先進(jìn)的流式細(xì)胞術(shù)，提高了數(shù)量檢測的敏感性。結(jié)果表明，SLE患者Vα24—VβllNKT細(xì)胞數(shù)量少于正常對照組，且NKT細(xì)胞CD69表達(dá)低于正常對照組。CD69是T細(xì)胞活化早期標(biāo)志分子，廣泛用于評價(jià)T細(xì)胞的活化程度。本試驗(yàn)SLE患者NKT細(xì)胞活化前CD69表達(dá)低于正常對照組，說明SLE患者不僅NKT細(xì)胞數(shù)量低于正常對照組，而且患者NKT處于抑制狀態(tài)。PDB+Ion體外活化6 h后，SLE患者和正常對照組NKT表達(dá)CD69分子明顯增多，正常對照組NKT幾乎全部活化。SLE患者NKT細(xì)胞CD69表達(dá)雖然低于正常對照組，但也能迅速活化。

用BFA與莫能菌素預(yù)孵內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的方法檢測NKT內(nèi)細(xì)胞因子INF-γ和IL-4，該方法可阻斷胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，使細(xì)胞因子聚集、蓄積后，增強(qiáng)的細(xì)胞因子信號被流式細(xì)胞儀檢測到。本研究結(jié)果顯示SLE患者NKT胞漿內(nèi)INF-γ活化前與正常對照組比較無明顯差異，而活化后INF-γ明低于正常對照組，活化前后SLE患者NKT胞漿內(nèi)IL-4明顯高于正常人，提示SLE患者存在NKT功能改變。NKT功能改變可能促進(jìn)患者免疫應(yīng)答向Th2誘導(dǎo)的體液免疫傾斜，而抑制Thl反應(yīng)。說明SLE患者主要針對自身多種抗原(DNA、核蛋白或血小板’細(xì)胞膜蛋白等)產(chǎn)生自身抗體，形成免疫復(fù)合物而介導(dǎo)免疫病損的發(fā)生。

Miyamoto等新合成了一種α-Galcer的類似物，它具有截短的神經(jīng)鞘氨醇鏈。 α-Galcer能刺激NKT產(chǎn)生IFN-γ和IL-4，而這種α-Galcer的類似物主要刺激NKT產(chǎn)生IL-4使免疫反應(yīng)向Th2型偏移，導(dǎo)致EAE疾病的抑制。而Frey等研究了在由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型鼠中NKT的作用，則得出完全相反的結(jié)論。他們發(fā)現(xiàn)，與正常鼠相比，糖尿病鼠中胸腺和脾臟中NKT細(xì)胞數(shù)量正常，但其分泌IL-4的數(shù)量大大下降，其外周組織中輔助T淋巴細(xì)胞主要發(fā)育成為Th1輔助細(xì)胞，使免疫反應(yīng)向Th1型偏移。這些結(jié)果證明NKT有兩種完全相反的調(diào)節(jié)模式。 NKT這種調(diào)節(jié)機(jī)制的多樣性也是迄今研究的重要方面本研究結(jié)果顯示，SLE患者NKT細(xì)胞數(shù)量，和NKT細(xì)胞分泌INF-γ減少及IL-4分泌增加，均促進(jìn)Th2反應(yīng)。目前，在免疫治療研究中也涌現(xiàn)出不少通過調(diào)控NKT功能即調(diào)節(jié)Thl與Th2反應(yīng)的轉(zhuǎn)換而抑制自身免疫病發(fā)生與發(fā)展的探討，本研究為激活NKT在SLE治療中的作用研究提供了一定的依據(jù)。

[1]西式內(nèi)科學(xué)，西安：世界圖書出版公司，1995．

[2]祝懷平，戴海明，孫自敏，等．流式細(xì)胞術(shù)檢測單個(gè)淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子表達(dá)．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2001,24：175.