產角蛋白酶菌株D5培養條件的研究

花萬里 石繪陸 俞春山 任 俊 李治斌

寧夏中衛山羊選育場，寧夏中衛755006

角蛋白以動物的毛發、羽毛、蹄等為主要形式存在于自然界中，一般情況下很難被降解，但作為角蛋白酶的專一性底物，可被其降解。微生物來源的角蛋白酶是目前酶領域研究的熱點之一，這類酶在醫藥、飼料、肥料、皮革、食品、紡織、日化等工業生產及環境治理方面都有廣闊的應用前景［1］。我國畜禽飼養與加工業規模很大，每年產生大量廢棄家禽羽毛。家禽羽毛的蛋白含量很高，而且富含動物所需的多種必需氨基酸，但是家禽羽毛的角蛋白穩定性非常強，很難被胃腸道內的消化酶消化，所以沒有得到有效的利用。家禽屠宰場廢棄物的大量排放已經給生態環境帶來嚴重的壓力［2］；同時，我國飼用蛋白質資源不足。如能對羽毛等角蛋白類物質加以利用，既可以避免環境污染又可以彌補飼用蛋白資源的不足。近年來，出現了利用高溫高壓降解和酸堿水解工藝生產的羽毛粉飼料，生產過程產生的廢水會對環境造成一定污染；同時，此種羽毛粉飼料價格比較高，而且其中的一些氨基酸（即蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸）遭到破壞，不易消化，營養價值不高［3］。

利用微生物發酵的方法制備雞羽毛蛋白粉具有上述工藝無法比擬的優勢［4］。首先，微生物發酵法制備雞羽毛蛋白粉工藝不需要高溫高壓，可減少能源的消耗；同時發酵過程只需要弱堿或中性環境，而且固體發酵模式可減少水資源的使用和污水的排放，這樣就能減輕對環境造成的壓力。這種工藝的另外一個優勢在于羽毛粉或新鮮的羽毛被微生物菌體和角蛋白酶協同作用后，二硫鍵被還原［5］，角蛋白的結構發生了改變，羽毛蛋白變得易消化，且氨基酸不被破壞，最大程度地提高了雞羽毛蛋白的營養價值［6－7］。

目前國內對角蛋白酶的研究處于篩選高產角蛋白酶菌株、對發酵菌株產酶條件的優化及酶蛋白的純化和生化性質研究階段，沒有發現有關角蛋白酶的工業化生產及應用的報道。角蛋白酶酶活力的測定方法有多種，測定的底物不同，加之各文獻的測定條件也不盡相同，因此，很難比較不同研究者的研究水平。在國外，目前以地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）PWD1生產角蛋白酶的發酵試驗研究已達到了工業化生產規模，并獲得了德國生物技術研究所（BRI）的生產許可，生產商品名為Versazyme的角蛋白酶商品，2006年開始投入市場［8－9］。本試驗通過測定不同影響因素條件下角蛋白酶的酶活力，確定了產角蛋白酶菌株D5的最佳培養基和最適發酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌種選擇

取中衛市某養雞場處土樣，經過多次分離純化，獲得1株能高效降解羽毛角蛋白的細菌D5。

1.2 試驗時間與地點

試驗于2013年6月在寧夏中衛山羊選育場實驗室和寧夏大學農學院實驗室進行。

1.3 發酵培養基的配制

牛肉膏：0.50%；水解雞羽毛粉：5.00%；磷酸氫二鉀：0.05%；蛋白胨：0.50%；硫酸銨：0.05%；硫酸鎂：0.01%；氯化鋅：0.01%；pH 7.50。

1.4 氮源對D5產蛋白酶影響的測定

在發酵培養基中分別加入5%的新鮮雞羽毛粉、5%的水解雞羽毛粉、5%的膨化雞羽毛粉，其他組分不變，測定不同氮源條件下發酵液的酶活力。

1.5 新鮮雞羽毛粉對D5產蛋白酶影響的測定

在發酵培養基中加入濃度分別為2%、3%、4%、5%的新鮮雞羽毛粉，其他條件不變，測定不同濃度的新鮮雞羽毛粉下發酵液的酶活力。

1.6 葡萄糖對D5產蛋白酶影響的測定

配制最佳發酵培養基，在發酵培養基中加入濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的葡萄糖，其他條件不變，測定不同濃度的葡萄糖下發酵液的酶活力。

1.7 蛋白胨對D5產蛋白酶影響的測定

配制最佳發酵培養基，在發酵培養基中加入濃度分別為0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的蛋白胨，其他條件不變，測定不同濃度的蛋白胨下發酵液的酶活力。

1.8 Mg2＋對D5產蛋白酶影響的測定

配制最佳發酵培養基，在發酵培養基中加入濃度分別為0.00%、0.01%、0.02%、0.04%的硫酸鎂，其他條件不變，測定不同濃度的Mg2＋下發酵液的酶活力。

1.9 起始pH值對D5產蛋白酶影響的測定

配制最佳發酵培養基，分別調節pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，測定不同pH 值下發酵液的酶活力。

1.10 培養時間對D5產蛋白酶影響的測定

配制最佳發酵培養基，培養時間分別為3、4、5d，其他條件不變，測定不同培養時間下發酵液的酶活力。

1.11 角蛋白酶酶活力的測定

采用Folin－酚試劑法［9］，將各發酵液50℃水浴1h，以TCA作為空白對照液（不水浴），其他步驟相同。在680nm波長下測定各發酵液吸光度和空白對照液吸光度，根據公式“酶活＝（發酵液吸光度－空白對照液吸光度）×100×稀釋倍數”計算酶活。

2 結果與分析

2.1 不同氮源對酶活的影響

不同氮源條件下，發酵液酶活的測定結果見圖1。

圖1 不同氮源對酶活的影響

由圖1可知，菌株利用水解雞羽毛粉的能力比利用其他氮源的能力強，酶活較高。因此，應選擇水解雞羽毛粉作為D5的氮源。

2.2 不同濃度新鮮雞羽毛粉對酶活的影響

不同濃度新鮮雞羽毛粉條件下，發酵液酶活的測定結果見圖2。

圖2 不同濃度新鮮羽毛粉對酶活的影響

由圖2可知，菌株利用濃度為2%的新鮮雞羽毛粉的能力比其他濃度的新鮮雞羽毛粉能力強，酶活較高。因此，應將2%的新鮮雞羽毛粉作為菌株D5產酶的最適酶活的濃度。

2.3 不同濃度葡萄糖對酶活的影響

不同濃度葡萄糖條件下，發酵液酶活的測定結果見圖3。

圖3 不同濃度葡萄糖對酶活的影響

由圖3可知，菌株利用濃度為2%的葡萄糖的能力比其他濃度的葡萄糖能力強，酶活較高。因此，應將2%的葡萄糖作為菌株D5產酶的最適酶活的濃度。

2.4 不同濃度蛋白胨對酶活的影響

不同濃度蛋白胨條件下，發酵液酶活的測定結果見圖4。

圖4 不同濃度蛋白胨對酶活的影響

由圖4可知，菌株利用濃度為2%的蛋白胨的能力比其他濃度的蛋白胨能力強，酶活較高。因此，應將2%的蛋白胨作為菌株D5產酶的最適酶活的濃度。

2.5 不同濃度Mg2＋對酶活的影響

不同濃度Mg2＋條件下，發酵液酶活的測定結果見圖5。

圖5 不同濃度硫酸鎂對酶活的影響

由圖5可知，菌株利用濃度為0.04%的硫酸鎂的能力比其他濃度的硫酸鎂能力強，酶活較高。因此，應將0.04%的Mg2＋作為菌株D5產酶的最適酶活的濃度。

2.6 不同起始pH值對酶活的影響

不同起始pH值條件下，發酵液酶活的測定結果見圖6。

圖6 不同pH值對酶活的影響

由圖6可知，菌株在pH 6.5的條件下產酶的酶活最高。因此，應將pH 6.5作為菌株D5產酶的最適酶活的pH值。

2.7 不同培養時間對酶活的影響

不同培養時間條件下，發酵液酶活的測定結果見圖7。

圖7 不同培養時間對酶活的影響

由圖7可知，菌株在培養第3天時產酶的酶活最高。因此，應將培養3d作為菌株D5產酶的最適酶活的培養時間。

3 討 論

培養基的起始pH值、培養時間等培養條件和培養基的組成對菌株的生長有很大的影響［10］。通過試驗測定不同因素條件下的酶活，確定產角蛋白酶菌株D5的優化培養基為：新鮮雞羽毛粉2.00%，酵母膏2.00%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸銨0.05%，蛋白胨2.00%，硫酸鎂0.04%，氯化鋅0.01%；優化發酵條件為：溫度37 ℃，pH 6.5，裝量80 mL／250mL錐形瓶，轉速150r／min，培養時間3d。

［1］ 曾毅，李忠琴，許小平.角蛋白酶的研究進展［J］.海峽藥學，2004，16（6）：102－131.

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［4］ 沈萍.微生物實驗［M］.北京：高等教育出版社，1999.

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