糖化血紅蛋白檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)化

劉德軍，彭旭東，王偉夫

（1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總參謀部警衛(wèi)局保健處）

糖化血紅蛋白檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)化

劉德軍1，彭旭東2，王偉夫2

（1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總參謀部警衛(wèi)局保健處）

近年來，糖尿病（DM）的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，已成為威脅人民群眾健康的第三大慢病。中國20歲以上成年人的DM發(fā)病率已達(dá)到9.7%［1］，早期發(fā)現(xiàn)DM和血糖水平的控制顯得非常重要?？崭寡?、餐后血糖和葡萄糖耐量試驗（OGTT）是國際上公認(rèn)的診斷DM的標(biāo)準(zhǔn)，但其只能反映瞬時血糖水平，容易受到各種因素的影響，糖化血紅蛋白（GHb）因其生物學(xué)特性，能夠反映最近2～3個月內(nèi)的平均血糖水平［2］，且不受空腹和胰島素治療的影響，因此它作為一個血糖監(jiān)測的重要指標(biāo)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。2010年美國糖尿病協(xié)會（ADA）在《2010年糖尿病診療指南》中正式將糖化血紅蛋白（HbA1c）納入DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，現(xiàn)就GHb的臨床檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)化作一綜述。

1 GHb的生化特性

GHb是指人體血液中結(jié)合了任何形式碳水化合物的血紅蛋白（Hb）。人類Hb可分為HbA（95%～97%）、HbA2（＜3%）、HbF（＜l%）。HbA中未結(jié)合糖類的為HbA0（90%）、結(jié)合糖的為HbAl（5%～7%）即GHb。HbA1c又可分為和HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbAlc，HbAlc占GHb的70%～90%，其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，組織中由葡萄糖的游離醛基與HbA的β鏈N末端纈氨酸進(jìn)行不可逆的非酶促反應(yīng)，稱為糖基化，GHb的形成主要取決于血糖濃度及血糖與Hb的接觸時間［2，4］，臨床上所測定的糖化血紅蛋白主要指HbAlc。

2 HbA1c檢測方法

HbA1c的檢測方法按其理化性質(zhì)可分為兩大類：一類是基于糖化與非糖化Hb所帶電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于Hb上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點，如親和層析法、免疫法和酶法［5-6］。不同檢測方法的結(jié)果存在差別，而糖尿病的診斷與血糖監(jiān)測要求測定值不受檢測方法的影響，因此不同檢測方法結(jié)果的可比性和標(biāo)準(zhǔn)化非常重要［7］。

2.1 離子交換層析法 主要有高效液相色譜法（HPLC），低效液相色譜法（LPLC）和手工微柱，廣泛采用的是HPLC。此方法是基于血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸糖化后所帶電荷不同而建立，應(yīng)用弱酸性陽離子交換樹脂，HbAlc由于所帶正電荷相對較少，在選定的低濃度洗脫液和接近中性的pH條件下，HbAlc首先被洗脫，從而與HbAla、HbAlb、HbF、不明蛋白組分、蛋白組分3、不穩(wěn)定GHb及HbS等分離［8］。所得到的的層析譜橫坐標(biāo)是時間，縱坐標(biāo)是百分比。HbAlc的值以HbA1c峰面積占Hb總面積的百分比來表示。此方法測定的HbAlc結(jié)果精確，準(zhǔn)確性和重復(fù)性高。美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）、糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化分會和國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化工作組建議，將HPLC方法作為檢測HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。雖然HPLC方法具有精度高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點，但其易受HbA1c前體、甲?；蛞阴；疕b、胎兒血紅蛋白（HbF）及變異血紅蛋白（HbS、HbE、HbC、HbD）的干擾，并受外界環(huán)境溫度的影響。在某些疾病情況下（如貧血、白血病、珠蛋白生成障礙性貧血、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥）HbF會異常升高，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差［10］。

2.2 電泳法 電泳法是基于糖化和非糖化Hb所帶電荷不同，于酸性緩沖液條件下（pH6.0）在瓊脂糖凝膠上泳動速度不同進(jìn)行分離檢測。電泳結(jié)束后，Hb各組分從負(fù)極到正極分別是HbA1a、HbA1b、HbAlc、HbA0，通過吸光度掃描，可計算得出HbA1c的百分含量。Doelman等［11］采用毛細(xì)管電泳法測定HbA1c，其結(jié)果不受氨基甲?；约耙阴b變異體的影響，其他Hb變異體（HbS、HbE、HbC、HbD）也不干擾本方法的準(zhǔn)確性。該方法的缺點是速度較慢，自動化程度低，所測結(jié)果與實驗員對電泳波峰的判斷有關(guān)，且設(shè)備費用昂貴，目前主要用于GHb的研究。

2.3 親和層析法 親和層析法利用硼酸鹽與整合在Hb上的葡萄糖順位二醇基可逆結(jié)合的特性，由Mallia等［12］于1981年研發(fā)的。通常使用間-氨基苯硼酸瓊脂糖，將血樣本加到層析柱后，所有的GHb與硼酸結(jié)合留在柱中，非GHb直接被洗出層析柱；再加入高濃度也包含順位二醇基的多羥基復(fù)合物（如山梨醇），GHb與硼酸的結(jié)合被山梨醇替換并被洗脫下來，分別測量兩組分，并計算比值。該方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確、精度較高且不受Hb變異體影響等優(yōu)點［9］。該方法目前可以標(biāo)準(zhǔn)化，且與HPLC有良好的相關(guān)性，比較適用于臨床監(jiān)測。

2.4 免疫法 免疫法利用抗原-抗體特異性反應(yīng)原理，將HbA1c的β鏈N末端最初的4～8個氨基酸作為抗體識別位點，制備相應(yīng)的單克隆抗體，血樣本中的HbA1c與相應(yīng)的單克隆抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，通過比色或比濁法測定HbA1c的含量。測定完HbA1c的含量后還需檢測Hb總量，從而計算出HbA1c的百分比。該方法快速、準(zhǔn)確、特異性強、重復(fù)性好，可在全自動生化儀上測定，不用另外購置儀器。近來發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白可影響檢測結(jié)果，且此方法受高血糖、三酰甘油、膽紅素的干擾。此外，在高濃度樣本的檢測中結(jié)果偏低，與抗體濃度不能達(dá)到相應(yīng)高度有關(guān)。

2.5 酶法 血樣本經(jīng)溶血處理后，由蛋白酶消化處理，糖基化的纈氨酸被釋放出來，作為果糖基纈氨酸氧化酶的底物，被氧化產(chǎn)生H2O2。H2O2的濃度與血樣本中HbAlc的含量成正比，在過氧化物酶催化下，與特定的色原耦聯(lián)，根據(jù)顏色變化程度可得H2O2的濃度，從而計算出HbAlc的含量，同時測定總Hb的濃度，計算HbAlc與Hb的濃度比值，得出HbA1c的百分比［13］。酶法檢測HbAlc可應(yīng)用于自動生化分析儀，具有操作簡便、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，特異性高等特點。檢測中處理后的血樣本與氧化還原劑反應(yīng)，減少了小分子和高分子物質(zhì)的干擾［14］。與作為金標(biāo)準(zhǔn)的HPLC法相比，測定結(jié)果具有良好的相關(guān)性［13］。

3 HbA1c檢測的標(biāo)準(zhǔn)化

實驗室中常用的HbAlc檢測方法因所用原理不同，加上各種因素的影響，使測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性都有所差異，導(dǎo)致各實驗室之間的結(jié)果缺乏可比性，對HbA1c在臨床上的應(yīng)用制造了障礙。

為解決HbA1c檢測結(jié)果可比性的問題，1984年P(guān)eterson等［15］首次提出檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化問題，對實驗室間各種方法的可比性和重復(fù)性進(jìn)行了評估。1995年國際臨床化學(xué)協(xié)會（IFCC）成立了HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化工作組，并于2002年發(fā)表了HbAlc的參考檢測體系［16］。新的參考體系形成了一個國際化的標(biāo)準(zhǔn)，2007年5月由美國糖尿病協(xié)會、歐洲糖尿病研究協(xié)會、國際糖尿病聯(lián)合會和IFCC提出共同協(xié)議，將在世界范圍內(nèi)形成HbAlc檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，并采用IFCC單位（mmol／mol）和美國國家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計劃（NGSP）單位（%）共同報告HbAlc結(jié)果［17］。

我國HbAlc測定標(biāo)準(zhǔn)化工作還處于起步階段。雖然早在2010年ADA已正式將HbAlc納入糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但我國的指南卻遲遲未將HbAlc寫入指南，主要還是由于我國很多地區(qū)HbAlc檢測尚不普遍，不同實驗室之間的結(jié)果缺乏可比性。王冬環(huán)等［18］的研究顯示，同一方法在不同實驗室間的變異系數(shù)在10%甚至20%以上，距離國際標(biāo)準(zhǔn)5%還有很大差距，使得HbA1在我國應(yīng)用于糖尿病的篩查、診斷、監(jiān)測上的效果大打折扣。我國為糖尿病大國，糖尿病患患者數(shù)已達(dá)9200萬，居世界首位，同時還有糖尿病前期患者1.48億［1］。為提高我國糖尿病患者的篩查、診斷、監(jiān)測和治療水平，盡早與國際接軌，建立起全國性的HbAlc檢測的標(biāo)準(zhǔn)化是擺在我們醫(yī)務(wù)工作者面前的一項重要工作。

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10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.041

2014-08-11）

劉德軍，主任醫(yī)師，Email：liudejun6721＠126.com