黃曲霉毒素的檢測及其降解方法進(jìn)展

劉立芳

（安徽省金標(biāo)準(zhǔn)檢測研究院有限公司，安徽 合肥 230088）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）代謝產(chǎn)生的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，對(duì)人類和家畜的健康有很大的危害性。早在1960年英國發(fā)生的10萬多只火雞死亡的“火雞X病”就是由于飼料被AFT污染引起的。AFT主要污染糧油類食品，如花生、玉米、大米等，其中以花生和玉米污染最嚴(yán)重[1]。在天然污染的食品和飼料中以黃曲霉毒素B1（AFB1）最為多見，其毒性也最強(qiáng)，被稱為第一大類致癌物[2]。由于AFT危害巨大，近幾十年來各國研究機(jī)構(gòu)和人員對(duì)AFT的檢測及降解方法開展了大量的研究，且目前仍在積極探索新的檢測方法，文中主要對(duì)幾類常見食品中AFT的檢測及降解方法進(jìn)行了綜述。

1 不同種類食品中黃曲霉毒素的檢測方法

AFT的檢測方法從最初以薄層層析法為主，發(fā)展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等多種方法，其進(jìn)展與新的化學(xué)檢測手段和新儀器的出現(xiàn)密不可分。

1.1 糧油及其制品中黃曲霉毒素的檢測方法

AFT對(duì)人類健康的危害主要是由于人們食用了被AFT污染的食物[3]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（food and agriculture organization，F(xiàn)AO）估計(jì)，全世界每年因AFT污染而不能直接食用的糧食占總產(chǎn)量的25%。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定AFT是目前國際上普遍采用的定量篩選和確認(rèn)的分析方法。用HPLC測定AFT一般分提取、凈化（富集）、衍生和測定幾個(gè)步驟。提取方法主要根據(jù)樣品的物理化學(xué)性質(zhì)來確定。AFT易溶于帶極性的溶劑，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈等[4-5]，對(duì)脂肪含量較高的樣品，可加入非極性溶劑正己烷進(jìn)行脫脂[6]。少量的水可以濕潤基質(zhì)，增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，提高提取效率，因此常采用有機(jī)溶劑與水的混合溶液作為提取液。STROKA J等[7]分別對(duì)3中提取液（對(duì)甲醇-水、乙腈-水和丙酮-水）的適用性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明甲醇-水的適用性廣，被推薦作為常用的提取劑。對(duì)AFT的凈化一般采用固相萃取的方法，主要分為兩類，免疫親和柱（immunoaffinity column，IAC）和多功能凈化柱（multifunctional purification column，MFC）。其中IAC較為常見。BRERA C等[8]用IAC凈化黃曲霉毒素，采用兩步洗脫法洗脫。李佩暖等[9]將使用過的免疫親和柱分別用甲醇-水、水沖洗，再用磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液進(jìn)行填充，放入冰箱于2～8℃保存，回收率和精密度均達(dá)到檢測要求，且柱體可重復(fù)使用2次。衍生方法常用的有柱前衍生法和柱后衍生法[10]。HPLC測定AFT選用的激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為450nm，以保留時(shí)間定性，峰面積定量，這些基本參數(shù)大致相同。

HPLC常與其他檢測器聯(lián)用以期獲得更快速準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，如高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）就是一種良好的檢測AFT方法[11]。特別是隨著大氣壓電離技術(shù)，尤其是電噴霧離子源技術(shù)發(fā)展逐步成熟，使HPLC-MS成為檢測AFT的強(qiáng)有力工具之一[12-13]。HPLC-MS法也是我國目前出口糧油及其制品中檢測AFT的首要方法[14]。

高志杰[15]采用HPLC以正己烷和三氯乙酸為衍生劑，同時(shí)測定花生及玉米種的4種AFT含量；王秀嬪等[16]建立了超聲提取-液相色譜-電噴霧三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測定玉米、大豆等糧油固體樣品中的4種AFT，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，極大提高了方法的準(zhǔn)確度；齊齊[17]采用酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法用甲醇-水對(duì)樣品進(jìn)行簡單的提取后在對(duì)提取液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，即可獲得比較滿意的結(jié)果，省去了用三氯甲烷進(jìn)行重復(fù)提取的步驟，不僅提高了回收率，也簡化了樣品的提取過程，提高了工作效率，減少了揮發(fā)性溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)人員可能產(chǎn)生的污染。

1.2 飼料中黃曲霉毒素的檢測方法

飼料中測定AFT的首選方法也是HPLC-MS法[18]。朱聰英等[6]建立了液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中6種AFT（包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）的方法。有效縮短了檢測時(shí)間，擴(kuò)展了檢測毒素種類，節(jié)約了檢測成本。

薄層層析法（thin-layer chromatography，TLC）是測定飼料中AFT的經(jīng)典方法，其原理是將樣品經(jīng)過提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色或黃綠色熒光，根據(jù)熒光大小和強(qiáng)弱與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性和定量。楊焱等[19]把粉碎過篩的樣品加水濕潤后，加入氯仿，振蕩、過濾，并將濾液在溫度65℃水浴上揮發(fā)干，再用苯-乙腈溶液轉(zhuǎn)移，通過點(diǎn)板，用乙醚預(yù)展后，再用氯仿-丙酮（92∶8）展開，在波長365nm的紫外光下觀察，根據(jù)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別顯示的藍(lán)紫色、藍(lán)紫色、綠色和藍(lán)色熒光，在掃描儀上繪制AFT掃描圖譜，并由此分辨出AFT種類；最后作定量分析，即以斑點(diǎn)面積的積分值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，得到樣品的AFT素含量。

1.3 乳及乳制品中黃曲霉毒素的檢測方法

動(dòng)物攝取AFT后會(huì)通過乳汁排出，乳（特別是牛乳）及其制品是人類尤其是嬰幼兒的主要食品，我國規(guī)定嬰幼兒配方食品中AFT不得超過0.5μg/kg[20]。檢測方法主要有液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、熒光分光光度法、酶聯(lián)免疫法等[21]。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是利用抗原和抗體兩者之間的特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)的方法，并且通過測定酶活力來增加靈敏度，能廣泛用于食品中對(duì)AFT的測定[22-23]。

酶聯(lián)免疫試劑盒提供的方法一般只針對(duì)鮮乳樣品，對(duì)于成分復(fù)雜的配方乳粉容易干擾酶聯(lián)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。梁迪思等[24]通過方法改進(jìn)，用甲醇-水（1∶1）提取再經(jīng)三氯甲烷凈化，能有效消除假陽性現(xiàn)象。周相娟等[25]建立了乳粉中AFM1的高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)的快速測定方法。張國梁等[26]利用高效液相色譜，建立了針對(duì)干酪中AFM1的快速高效的檢測方法。

2 黃曲霉毒素的降解方法

AFT的治理以預(yù)防為主，污染嚴(yán)重的糧食和飼料應(yīng)當(dāng)廢棄，對(duì)于輕度污染的則必須進(jìn)行脫毒處理。脫毒方法一般有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物降解脫毒法。

2.1 物理脫毒法

物理脫毒法方法簡單，常用的有挑選法、高溫處理法、加工法、吸附法、輻射法等。張國輝等[27]在飼料中加入水合鋁硅酸鈉鈣、沸石、膨潤土、活性炭等可以吸附大部分AFT。物理脫毒法常常不能使AFT失去活性，而且對(duì)原來的營養(yǎng)成分破壞比較大。

2.2 化學(xué)脫毒法

AFT在堿性條件下不穩(wěn)定，內(nèi)酯環(huán)被破壞，反應(yīng)生成鄰位香豆素鈉鹽，這種鈉鹽能溶于水，故加堿后再用水洗可將毒素除去。但該法設(shè)備投資大，成本高，已逐漸被淘汰[28]。

氨能同AFB1發(fā)生脫羥基作用，因此可以用氨處理法脫除AFT[29]。陳志娟等[30]研究采用氨氣熏蒸法降解玉米中AFB1的最優(yōu)條件：玉米含水量為20%，氨熏溫度37℃，氨熏時(shí)間為96h，氨氣體積分?jǐn)?shù)為7.05%，在此條件下玉米中AFB1降解率為92%。

臭氧熏蒸法是基于物理和化學(xué)氧化雙重作用的脫毒方法。陳冉等[31]研制了一種花生AFT污染臭氧脫毒專用裝置，以下部通入臭氧氣體，上部排氣的方式，臭氧濃度6.0mg/L、處理時(shí)間30min、花生水分含量為5%時(shí)，花生中AFT總量和AFB1的脫毒率分別為65.88%和65.90%，脫毒效果顯著。

2.3 生物學(xué)脫毒法

生物學(xué)脫毒是近年來國內(nèi)外研究AFT脫毒解毒的熱點(diǎn)[32]，主要是微生物菌體本身及其細(xì)胞壁提取物吸附AFT，或微生物代謝產(chǎn)生的酶，或從植物中提取的酶降解AFT。生物學(xué)脫毒法同其他方法相比具有安全性高，處理?xiàng)l件溫和，專一性強(qiáng)，不影響食品的營養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)，目前報(bào)道的能夠降解黃曲霉毒素的細(xì)菌不多，有橙色黃桿菌（Flavobacterium aurantiacum）、分支桿菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）、紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis）、橙紅色粘球菌（Myxococcus fulvus）等[33]。

王寧等[34]對(duì)1株具有降解AFB1活性的黏細(xì)菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：酵母粉7g/L、CaCl2·2H2O為1g/L、MgSO4·7H2O為0.5g/L、VB12為750μg/L；并確定其最佳培養(yǎng)條件為：初始pH7.5、接種量20%、發(fā)酵時(shí)間50h、發(fā)酵溫度30℃。在上述最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件下，該菌株降解AFB1的能力為78.2%。劉睿杰等[35]對(duì)篩選出的巨大芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在料水比1∶1.1，發(fā)酵溫度35.9℃，發(fā)酵時(shí)間64.3h條件下，花生粕中AFB1的去除率達(dá)68.54%。吉小鳳等[36]篩選出具有脫除AFB1的發(fā)酵乳桿菌株LAB-10，該菌株屬于益生菌，生物安全性高，對(duì)質(zhì)量濃度為14μg/L的AFB1在48h的降解率為63.4%，其脫毒機(jī)理為生物降解作用。于會(huì)民等[37]通過添加AFT酶制劑能有效消除AFT對(duì)仔豬的危害。尹遜慧等[38]添加AFT解毒酶制劑減輕或基本消除了AFT對(duì)肉雞生長性能和組織器官的不良影響。

3 存在的問題及展望

AFT檢測方法近年來有了很大的發(fā)展，許多新方法、新手段的應(yīng)用，為AFT的檢測提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測目的和要求。但由于國際和國內(nèi)AFT限制正在逐步加強(qiáng)，限量標(biāo)準(zhǔn)也在不斷降低，所以需要找到一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡便快速，容易普及應(yīng)用的方法來檢測AFT。對(duì)AFT的脫毒方法現(xiàn)在雖然有很多種，但從安全經(jīng)濟(jì)的角度考慮，防毒應(yīng)比脫毒更重要。生物降解處理?xiàng)l件溫和，安全性高，但生物降解的反應(yīng)條件苛刻，成本較高，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有所限制，因此探尋高效、廉價(jià)的微生物及其制劑，是生物學(xué)脫毒得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

[1]Ding X X，LI P W，BAI Y B,et al.Aflatoxin B-1 in post-harvest peanuts and dietary risk in China[J].Food Control,2012,23(1):143-148.

[2]RODRIGUEZ VELASCO M L,CALOGNE DELSO M M,ORDONEZ ESCUDERO D.ELISA and HPLC determination of the occurrence of aflatoxin Mlin raw cow’s milk[J].Food Addit Contam,2003,20(3):276-280.

[3]李書國，陳 輝，李雪梅，等.糧油食品中黃曲霉毒素檢測方法綜述[J].糧油食品科技，2009，17（2）：62-65.

[4]SHEIJOONI-FUMANI N,HASSAN J,YOUSEFI S R.Determination of aflatoxin B1 in cereals by homogeneous liquid-liquid extraction coupled to high performance liquid chromatography-fluorescence detection[J].J Sep Sci,2011,34(11):1333-1337.

[5]LATTANZIO V M T,DELLA GATTA S,SUMAN M,et al.Development and in-house validation of a robust and sensitive solid-phase extraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the quantitative determination of aflatoxins B1,B2,G1,G2ochratoxin A,deoxynivalenol,zearalenone,T-2 and HT-2 toxins in cereal-based foods[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2011,25(13):1869-1880.

[6]朱聰英，應(yīng)永飛，韋敏玨，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中黃曲霉毒素的研究[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2010，31（4）：240-246.

[7]STROKA J,PETZM,JOERISSEN U,et al.Investigation of various for the analysis of aflatoxinB1 in different food and feed matrices[J].Food Addit Contam,1999,16(8):331-338.

[8]BRERA C,DEBEGNACH F,DESANTIS B,et al.Simultaneous determination of aflatoxins and ochratoxin A in baby foods and paprika by HPLC with fluorescence detection:A single-laboratory validation study[J].Talanta,2011,83(5):1442-1446.

[9]李佩暖，曹 鵬，耿金培，等.黃曲霉毒素前處理方法的研究—免疫親和柱的重復(fù)利用[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2009，19（5）：21-24.

[10]QUINTO M,SPADACCINO G,PALERMO C,et al.Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection[J].J Chromatogr A,2009,1216(49):8636-8641.

[11]LIU S Y,FENG Q,WEI J K,et al.Development and validation of an accurate and rapid LC-ESI-MS/MS method for the simultaneous quantification of aflatoxin B1,B2,G1and G2in lotus seeds[J].Food Control,2013,29(3):156-161.

[12]KOKKONEN M,JESTOI M,RIZZO A.Determination of selected mycotoxins in mould cheeses with liquid chromatography coupled to tandem with mass spectrometry[J].Food Addit Contam,2005,22(5):449-456.

[13]宮小明，任一平，董 靜，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花生、糧油中18 種真菌毒素[J].分析測試學(xué)報(bào)，2011（1）：6-12.

[14]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 3136-2012 出口花生、谷類及其制品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2 毒素、HT-2 毒素的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[15]高志杰.HPLC 法同時(shí)測定食品中的4 種黃曲霉毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)，2007，17（10）：1803-1804.

[16]王秀嬪，李培武，楊 揚(yáng)，等.液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定糧油中的黃曲霉毒素[J].色譜，2011，29（6）：517-522.

[17]齊 齊.ELISA 法檢測花生醬中黃曲霉毒素B1前處理方法的改進(jìn)研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（8）：1524-1525.

[18]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 2071-2011 飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[19]楊 焱，宓曉黎，成恒嵩，等.薄層掃描法測定飼料中黃曲霉毒素B1的含量[J].飼料工業(yè)，1996，17（10）：36-37.

[20]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761-2011 食品中真菌毒素限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

[21]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.37-2010 乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測定[S].北京：中國出版社，2010.

[22]PEI S C,ZHANG Y Y,EREMIN S A,et al.Detection of aflatoxin M1in milk products from China by ELISA using monoclonal antibodies[J].Food Control,2009,20(12):1080-1085.

[23]RADOI A,TARGA M,PRIETO-SIMON B,et al.Enzyme-Linked immunosorbent assay(ELISA) based on superparamagnetic nanoparticles for aflatoxin M1 detection[J].Talanta,2008,77(1):138-143.

[24]梁迪思，李建生.酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定嬰幼兒配方奶粉中的黃曲霉毒M1方法改進(jìn)[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（12）：1421-1423.

[25]周相娟，王 浩.快速測定乳粉中黃曲霉毒素M1殘留[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械，2012（6）：143-145.

[26]張國梁，鄭冬梅，李曉東，等.親水親脂平衡柱萃取高效液相色譜法快速測定干酪中的黃曲霉毒素M1[J].中國釀造，2013，32（4）：141-143.

[27]張國輝，何瑞國，齊德生.飼料中黃曲霉毒素脫毒研究進(jìn)展[J].中國飼料，2004（16）：36-38.

[28]李培武，張道宏，楊 揚(yáng)，等.糧油制品中黃曲霉毒素脫毒研究進(jìn)展[J].中國糧油作物學(xué)報(bào)，2010，3（2）：315-319.

[29]肖軍霞，張 巖，黃國清，等.黃曲霉毒素脫除方法研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2012，3（5）：395-399.

[30]陳志娟，劉 陽，邢福國，等.氨氣熏蒸降解玉米種黃曲霉毒素B1的條件優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2010，31（8）：33-37.

[31]陳 冉，李培武，馬 飛，等.花生黃曲霉毒素污染臭氧脫毒技術(shù)研究[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2013，35（1）：92-96.

[32]劉 暢，劉 陽，邢福國.黃曲霉毒素生物學(xué)脫毒方法研究進(jìn)展[J].食品科技，2010，35（5）：290-293.

[33]ZHAO L H,GUAN S,GAO X,et al.Preparation,purification and characteristics of an aflatoxin degradation enzyme from Myxococcus fulvus ANSM068[J].J Appl Microbiol,2011,110(1):147-155.

[34]王 寧，馬秋剛，計(jì) 成，等.黏細(xì)菌降解黃曲霉毒素B1的產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（2）：27-31.

[35]劉睿杰，常 明，孫豐芹，等.響應(yīng)面優(yōu)化巨大芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵去除花生粕中黃曲霉毒素B1的研究[J].中國油脂，2013，38（3）：28-30.

[36]吉小鳳，張巧艷，李文均，等.黃曲霉毒素B1脫毒菌株LAB-10 的分離、鑒定及降解能力分析[J].微生物學(xué)通報(bào)，2012，39（8）：1094-1101.

[37]于會(huì)民，梁陳沖，陳寶江，等.黃曲霉毒素解毒酶制劑對(duì)飼喂黃曲霉毒素B1飼糧的斷奶仔豬生長性能及肝臟生化指標(biāo)的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2013（4）：805-811.

[38]尹遜慧，陳善林，曹 紅，等.日糧添加黃曲霉毒素解毒酶制劑對(duì)黃羽肉雞生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)和毒素殘留的影響[J].中國家禽，2010（2）：29-33.