玉米芯復合酶法制備低聚木糖工藝的研究

湯衛華，殷海松，劉鵬，龍尾

（天津現代職業技術學院生物工程學院，天津300350）

低聚木糖（xylo-oligosaccharide，XO）是水解木聚糖的β-1，4-糖苷鍵，產物是以木二糖、木三糖和木四糖等組成的木寡糖混合物[1]。低聚木糖甜味純正，難被人體消化吸收，腸道內殘存率高，具有極好的雙歧桿菌增殖性，其選擇利用性高于其他功能性低聚糖[2]，被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等領域。

制備低聚木糖的主要方法包括酸水解法，熱水抽提法，酶水解法和微波降解法四種。由于酸水解法要求高、設備投入大、反應產物復雜；熱水抽提產物色澤深、精制工藝繁瑣；微波降解法仍處于實驗室階段[3]。因此酶法是目前水解木聚糖最常采用的方法。

木聚糖是半纖維素的一種，植物細胞壁中的結構性非淀粉多糖，在植物細胞壁中的含量僅次于纖維素。在植物細胞壁中，木質素中的阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸類物質以酯鍵方式與半纖維素支鏈形成致密網狀交聯結構，從空間上限制微生物對植物細胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，這也是影響木聚糖酶酶解效率的主要因素之一[4]。因此，要提高木聚糖酶酶解效率，首先要破壞半纖維素與木質素、纖維素的交聯架構，而單一的酶不可能對所有的糖苷鍵產生作用，因此要完全降解木聚糖需要幾種不同酶的協同作用。本文研究阿魏酸酯酶，木聚糖酶和漆酶復合使用時，可以通過協同作用有效降解致密網狀交聯結構，促進植物細胞壁半纖維素的酶解產率，提高酶解液中低聚木糖的含量，為后續產品的分離純化打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：市售；漆酶（1.2×105IU/g）、阿魏酸酯酶（1.5×104IU/g）、木聚糖酶（1.5×104IU/g）：寧夏夏盛集團；其他化學試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

F2102 型粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；ZNXMTF-2000 酶解罐：鎮江東方生物工程設備技術公司；SHA-BA 恒溫振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Delta-320 型酸度計：梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米芯的預處理

選擇風干的、無發霉的玉米芯用粉碎機粉碎過80目篩，備用。

1.3.2 復合酶制劑酶解玉米芯制備低聚木糖的正交試驗

在單因素實驗的基礎上進行正交試驗，以低聚木糖的得率為考察指標，進一步優化復合酶制劑的配比，正交試驗因素水平設計如表1所示。

表1 正交實驗因素水平Table1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.3.3 低聚木糖含量及得率的測定[5]

依據3，5-二硝基水楊酸法（DNS 法）測定酶解液中還原糖含量，以還原糖含量代表酶解后的低聚木糖含量。

低聚木糖產率（%）=酶解液還原糖含量（g/L）×酶解液體積（L）/玉米芯干重×100%

1.3.4 復合酶制劑的作用條件對低聚木糖產量的影響

1.3.4.1 反應溫度對低聚木糖含量的影響

料液比為1∶20，反應時間為4 h，考察反應溫度為30、40、50、60、70 ℃下作用5 h 后，測定低聚木糖的含量。

1.3.4.2 反應時間對低聚木糖含量的影響

料液比為1∶20，反應溫度為50 ℃，考察復合酶制劑作用0、2、4、6、8 h 后，測定低聚木糖的含量。

1.3.4.3 料液比對低聚木糖含量的影響

將料液比調至1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40，復合酶制劑反應時間為4 h，反應溫度為50 ℃，測定低聚木糖含量。

2 結果與分析

2.1 復合酶制劑的配比對低聚木糖含量的影響

按照1.3.2 正交試驗設計進行正交試驗，復合酶制劑加入到料液比為1∶20 的玉米芯，于55 ℃下水解6 h，計算低聚木糖的得率，正交結果分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交結果分析Table2 Orthogonal Results

表3 方差分析表Table3 Variance analysis of results

由表2和表3可以看出阿魏酸酯酶（A）、漆酶（B）及木聚糖酶（C）的影響順序為C>B>A，組合A2B3C2最好，即阿魏酸酯酶0.2%、漆酶0.3%和木聚糖酶0.6%。

2.2 復合酶制劑的酶解條件對低聚木糖得率的影響

按照1.3.5 的條件，考察水解溫度、水解時間和料液比對低聚木糖得率的影響，結果如圖1（a），1（b），1（c）所示。

圖1 復合酶制劑酶解條件對玉米芯中低聚木糖得率的影響，1（a）水解溫度；1（b）水解時間；1（c）料液比（g∶mL）Fig.1 Effect of hydrolysis conditions on xylooligosaccaride yield，1（a）hydrolysis temperature；1（b）hydrolysis temperature time；1（c）solid-liquid ratio

圖1（a）顯示，隨著酶解溫度的提高，酶解產物低聚木糖得率也提高，當溫度提高至50 ℃，低聚木糖得率達到65.2%，進一步提高水解溫度，低聚木糖得率不再提高，因此選擇復合酶制劑的水解溫度選擇為50 ℃。圖1（b）的結果顯示，低聚木糖的得率隨著水解時間提高而增加，當水解時間達到4 h 后，再繼續水解，低聚木糖得率增加速度緩慢，因此選擇復合酶制劑的水解時間為4 h。從圖1（c）可知，料液比為1∶20時，低聚木糖的得率達到最高，為68.5 %，因此酶解料液比選擇1∶20（g∶mL）。

在水解溫度為50 ℃、水解時間為4 h、料液比為1∶20 的條件下，復合酶制劑酶解玉米芯后，低聚木糖的含量達到16.8 mg/mL，比單一酶制劑木聚糖酶的作用提高了64.7%（圖2）。

由圖2可知，復合酶制劑中漆酶和阿魏酸酯酶起到很好的協同作用，阿魏酸酯酶，又稱為肉桂酸酯酶，是一種羧酸酯水解酶，可以水解阿魏酸與半纖維素之間的酯鍵，從而破壞細胞壁的骨架結構，使原料結構更為疏松[6]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，可以破壞玉米芯中半纖維素酯鍵，有效降解細胞壁中的木質素，削弱木質素對半纖維素木聚糖的屏蔽作用[7-8]。在漆酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，使玉米芯中木聚糖從細胞壁中大量釋放出來，木聚糖更容易結合至木聚糖酶的結合位點，促進玉米芯的降解和低聚木糖的產生。

圖2 復合酶制劑和單一酶制劑的酶解效果比較Fig.2 Changes of xylooligosaccaride yield on compound enzyme and single enzyme hydrolysis

3 結論

正交試驗確定復合酶制劑影響順序為木聚糖酶>漆酶>阿魏酸酯酶，復合酶制劑中阿魏酸酯酶、漆酶和木聚糖酶添加量分別為0.2%、0.3%和0.6%。復合酶制劑的反應條件分別是水解溫度為50℃、水解時間為4 h、料液比為1∶20（g∶mL）。在最適條件下復合酶制劑處理玉米芯原料后，低聚木糖含量達到16.8 mg/mL，比單一酶制劑木聚糖酶提高了64.7%。

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