秦巴山區柿葉中揮發性成分及抗氧化性研究

豆佳媛，王奇，馮鞏

（陜西理工學院 化學與環境科學學院，陜西漢中723000）

柿葉為雙子葉柿樹科（Ebenanceae） 柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的葉。柿樹為常綠或落葉喬木或灌木，主要生長在熱帶和溫帶，約有6 屬450種，其中我國有柿樹2 屬50 多種，栽培面積約2.0×105hm2，產量占世界總產量的50%以上，是世界上最主要的柿樹生產國。柿樹在我國已2000 多年的栽培歷史，也是我國重要的經濟樹種之一。柿葉中含有豐富的維生素C、黃酮、蘆丁、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對人體有益的營養成分，具有較高的營養價值和醫療保健作用。目前，我國柿葉開發的產品種類較少，品質低。最成功的是在柿葉茶制備技術的研究上。關于柿葉化學成分的研究報道較少，其揮發性成分及生物活性的研究國內外更少有報道，而且主要集中在揮發油提取工藝和化學成分分析研究上[1-5]。近年來的研究表明柿葉具有明顯的抗氧化作用。石錦芹等[6-7]的研究表明，柿葉無水甲醇提取物對豬油的抗氧化作用較強，優于柿葉無水乙醇提取物、體積分數70%甲醇提取物和體積分數70%乙醇提取物；而柿葉水提取物的抗氧化作用不明顯。用不同溶劑提取的柿葉提取物的抗氧化性能不同。馬希漢等[8]研究認為，柿葉的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物均有很強的抗氧化作用，而以石油醚提取物抗氧化作用最強。對上述各類提取物中有效成分的系統分析還未見到報道。為了開發利用柿葉，本文僅報道作者對其脂溶性揮發性成分用GC/MS/DS 聯用技術分離鑒定及相對含量的測定結果，并進行了抗氧化活性的研究。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

GC6890N/MSD5973N 色質聯用儀：美國安捷倫公司；PDP11/24 計算機及11/250 數據處理系統；UV-6系列紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；101 型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

經過處理的無水乙醚、石油醚、氯化鈉、無水硫酸鈉、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉等試劑均為分析純。

1.2 樣品及揮發性成分的提取

被分析的柿葉取自秦巴山區（5月初的鮮葉）用自來水將鮮柿葉洗凈、風干、粉碎，取300 g 放入索氏提取器用石油醚提取，減壓濃縮后，在100 mL 燒瓶內，加水至瓶1/2 高處使試樣完全浸透后進行蒸餾，蒸至餾出物無味為止。蒸出物中加入25 g/L 的氯化鈉水溶液以提高萃取率[9]，萃取3 次，用無水硫酸鈉除去萃取液中的水，揮發乙醚后得到黃綠色揮發油，有較濃的清香味，待用。

1.3 GC/MS 分析

測試條件：GC 汽化室溫度250 ℃，HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，50 ℃恒溫2 min，然后以4 ℃/min 的升溫速率由80 ℃程序升溫至290 ℃，恒溫30 min，載氣為99.999%高純氦。

MSD 離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV；使用美國NIST05 譜庫。

2 結果與討論

2.1 脂溶性揮發性成分

柿葉的揮發油，經氣相色譜質譜分離出26 個組分，見表1。

經氣相色譜質譜聯用技術對揮發性物質進行分離和鑒定，運用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對含量，分離出26種組分，鑒定出26 中化合物，其中有21種含氧化合物，其在揮發性成分中的質量分數為84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）為主。這26 個組分中，酚類物質有5種，酮類物質有4種，酸類物質有4種，醛類物質有2種，酯類物質有1種，醇類物質有1種，其中酚類物質相對含量為44.915%，是柿葉揮發油的主要成分，說明柿葉揮發油具有較強的抗氧化作用。

表1 柿葉中揮發油組分分析Table1 The components analysis of volatile oils in Persimmon leaves

2.2 體外·OH 自由基清除作用考察

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]測定Fe2+/ H2O2體系中·OH 自由基清除率。準確稱取柿葉揮發油0.087 g，用蒸餾水配制成0.18g/L 的柿葉揮發油溶液，取6 只已編號的25 mL 容量瓶，分別加入0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液1.0 mL，pH 7.4 的0.2 mol/L PBS（磷酸鹽緩沖液）1.5 mL，混合均勻，分別加入0.75 mmol/L 新配置的硫酸亞鐵溶液1.0 mL，向1～6 號量瓶中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 柿葉揮發油溶液，搖勻，再向每只量瓶中加入新配制的0.01 % H2O2溶液1 mL，另取2只25 mL 量瓶并分別標記為損傷管和未損傷管，這2 只量瓶中均不加柿葉揮發油溶液，且在損傷管中加入0.01%H2O2溶液1 mL，未損傷管不加H2O2，用蒸餾水將8 只容量瓶定容到至刻度，充分搖勻，于37 ℃恒溫水浴中培養60 min，取出，冷卻至室溫，于512 nm 測定吸光度（n=3）。按下式計算·OH 自由基清除率（I）。

式中：A2為柿葉揮發油溶液的吸光度；A1為未損傷溶液的吸光度；A0為損傷溶液的吸光度。繪制柿葉揮發油質量濃度-清除率曲線見圖1。

圖1 柿葉揮發油對體外·OH 自由基清除作用曲線Fig.1 Volatile oils in persimmon leaves of·OH radical scavenging effect in vitro

由圖1可知，柿葉揮發性物質對H2O2/Fe2+體系通過Fenton 反應產生的·OH 自由基有明顯的清除作用，且隨著揮發油濃度的增加呈明顯的上升趨勢，當濃度為0.008 6 g/L 時，體外·OH 自由基清除率達44.95%，充分說明了柿葉揮發性物質具有較強的抗氧化活性。

3 結論

用GC/MS/DS 聯用技術測定對秦巴山區五月份柿葉用石油醚提取、水蒸氣蒸餾提取其中脂溶性揮發性化學成分進行分離和鑒定，運用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對含量。分離出26種組分，鑒定出26 中化合物，其中有21種含氧化合物，其在揮發性成分中的質量分數為84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）為主。同時對其抗氧化活性進行考察。柿葉中揮發油對Fe2+/H2O2體系·OH 基自由基的清除作用，隨著加入量的增加，清除率呈明顯的上升趨勢，當達到一定濃度時，其對·OH 自由基的清除率基本保持不變。清除率和柿葉中揮發性物質用量存在一定的量效關系，均可以說明柿葉中揮發油具有很強的抗氧化性。該研究尚屬首例，為進一步柿葉的利用提供理論支撐，柿葉的其他生物活性實驗和開發利用還有待研究。

[1] 安秋榮,郭志峰.柿葉揮發成分的GC/MS 分析[J].河北大學報:自然科學版,1999,19(3):256-259

[2] 紀莉蓮,張強華,崔桂友.柿葉抗菌活性的研究及活性成分的分離鑒定[J].食品科學,2003,24(3):129-131

[3] 柯范生,林嬌芬,林河通.安溪油柿葉的營養成分分析與評價[J].包裝與食品機械,2009,27(1):26-28

[4] 林嬌芬,林河通,謝聯輝,等.柿葉的化學成分、藥理作用、臨床應用及開發利用[J].食品與發酵工業,2005,31(7):90-96

[5] 張穎,岳紅,趙曉麗.水蒸氣蒸餾法提取柿葉精油的工藝研究[J].林產化工通訊,2004,38(6):26-29

[6] 石錦芹,胡小峰,郭開宇.柿葉黃酮粗提物抗氧化作用的研究[J].中國畜產與食品,1999,6(3):128-129

[7] 石錦芹,黃紹華,諶樂禮,等.柿葉乙醇提取物在豬油中的抗氧化性研究[J].食品工業科技,1999,20(5):22-23

[8] 馬希漢,尉芹.柿葉抗氧化作用的研究[J].西北林學院學報,2000,15(2):41-44

[9] 金鳴,蔡亞欣,李金榮,等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測H2O2/Fe2+產生的羥基自由基[J].生物化學與生物物理進展,1996,23(6):553