煙草重要基因篇：2. 煙草鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

王 倩，劉好寶

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101)

煙草重要基因篇：2. 煙草鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

王 倩，劉好寶

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所,青島 266101)

煙草是典型的喜鉀作物。除了作為重要的營(yíng)養(yǎng)元素發(fā)揮作用外,鉀能明顯增強(qiáng)煙株的抗病蟲(chóng)、抗逆能力,提高煙葉的燃燒性。同時(shí),鉀還通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的生化反應(yīng)影響細(xì)胞中的有機(jī)酸、氨基酸和糖等化學(xué)成分,改善煙葉的品質(zhì)[1]。因此,鉀含量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。長(zhǎng)期以來(lái),煙草鉀素營(yíng)養(yǎng)研究主要集中于鉀肥種類(lèi)與品質(zhì)關(guān)系、鉀肥施用方法及施用量、土壤 pH 對(duì)鉀素吸收的影響及土壤供鉀特性等方面,其分子機(jī)制研究起步較晚。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,煙草鉀營(yíng)養(yǎng)的遺傳、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等研究取得了較大進(jìn)展。開(kāi)展煙草鉀營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)研究,充分挖掘鉀營(yíng)養(yǎng)高效基因,培育鉀營(yíng)養(yǎng)高效煙草品種,不僅符合煙草行業(yè)降焦減害的主旨,也為研究其他喜鉀作物的鉀營(yíng)養(yǎng)機(jī)制、改善作物品質(zhì)、提高鉀肥利用率、緩解我國(guó)鉀肥貧瘠的現(xiàn)狀提供科學(xué)借鑒,具有重大的生產(chǎn)應(yīng)用和理論研究意義。

植物對(duì)鉀的跨膜吸收機(jī)制主要有兩種,即高親和性鉀吸收系統(tǒng)(機(jī)制Ⅰ)和低親和性鉀吸收系統(tǒng)(機(jī)制Ⅱ)。高親和性鉀吸收是植物在低鉀濃度(0.001～0.2 mM)下的主要吸收途徑,K+多通過(guò)鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的主動(dòng)運(yùn)輸逆電化學(xué)勢(shì)梯度進(jìn)入細(xì)胞,需要消耗能量；低親和性鉀吸收主要在高鉀濃度(1～10 mM)下發(fā)揮作用,K+多通過(guò)鉀通道調(diào)節(jié)的被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞,該過(guò)程依賴細(xì)胞膜電勢(shì)[2]。更深入的研究表明植物中的鉀吸收情況要復(fù)雜于上述簡(jiǎn)單的劃分。K+進(jìn)入根部細(xì)胞后,由鉀通道或鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體將其運(yùn)往植物的各個(gè)組織[3]。植物對(duì)鉀的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受到一系列鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及調(diào)控因子的共同調(diào)節(jié)。目前煙草鉀吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的研究主要集中于鉀通道、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)調(diào)控基因三個(gè)方面。

1 鉀通道

植物中的鉀通道分為 Shaker 家族鉀通道、TPK 家族鉀通道和 Kir-like 家族鉀通道三類(lèi)[4]。Shaker 家族是介導(dǎo)植物鉀營(yíng)養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞鉀離子動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程的最為重要的鉀通道蛋白,也是煙草鉀營(yíng)養(yǎng)中研究最早的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。到目前,煙草中報(bào)道的鉀通道共有10個(gè),分別是圓錐煙草的 NpKT1、黃花煙草的NKC1、普通煙草的 NtKC1、NTORK1、NKT1、NKT2、NKT3、NKT4、NKT5 和林煙草的 NKT6。Hashimoto 等(1999)從圓錐煙草(Nicotiana paniculata)中克隆得到第一個(gè) Shaker鉀通道基因 NpKT1,但相關(guān)功能研究未見(jiàn)報(bào)道。隨后,Sano 等(2007)在對(duì)植物細(xì)胞周期的研究中,以煙草 BY-2 細(xì)胞系為材料,克隆得到四個(gè) Shaker 鉀通道基因 NKT1、NKT2、NtKC1 和 NTORK1[5]。其中,前三個(gè)分別與擬南芥 Shaker 鉀通道AKT1、AKT2/3 和 AtKC1 存在同源性,經(jīng)鑒定均具內(nèi)向整流 Shaker 鉀通道活性；NTORK1 與擬南芥SKOR/GORK 鉀通道亞族同源,均屬于外向整流 Shaker鉀通道。研究發(fā)現(xiàn),NKT1 在 G1 期中表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的鉀吸收,而 NTORK1 主要在 S 期中表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的鉀外流,表明鉀通道參與煙草的細(xì)胞周期調(diào)控[5]。郭兆奎等[6](2008)國(guó)內(nèi)首個(gè)報(bào)道的鉀通道基因?yàn)辄S花煙草(Nicotiana rustica)的 NKC1,該基因與馬鈴薯 Shaker鉀通道 SKT1 同源,在煙草幼根、葉片和花等器官均有表達(dá),在幼根中轉(zhuǎn)錄量最多,缺鉀處理可顯著誘導(dǎo)根系中該基因的轉(zhuǎn)錄,而高濃度 NH4+處理對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。劉好寶等利用 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)相繼獲得了 4 個(gè)鉀通道基因,分別命名為 NKT3[7]、NKT4[8]、NKT5[9]和 NKT6[10]。其中前三個(gè)基因均從煙草鉀高效基因型 Special Warne 中獲得,NKT6 從林煙草中獲得。NKT3和 NKT5 與擬南芥 AtKC1 同源[7,9]；NKT4 與擬南芥 AKT1、番茄 LKT1 和馬鈴薯 SKT1 的氨基酸序列相似性分別為 71%、90%和 90%,主要在煙草根部尤其是幼嫩側(cè)根中表達(dá),在低鉀和干旱處理早期,該基因的轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào),推測(cè)該基因在低鉀和干旱等脅迫條件下發(fā)揮重要作用[8],可能與黃花煙草 NKC1 是同工蛋白。NKT6 屬于 Shaker家族 Group II,在林煙草的莖和腋芽中最高,在萼片、葉、花中次之,在根中最低,蛋白主要定位于細(xì)胞膜和核膜附近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。干旱與外源 ABA 脅迫處理下該基因的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì),推測(cè)可能參與林煙草的氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)過(guò)程[10]。

煙草 TPK 家族基因研究尚處于起步階段,目前只報(bào)道了兩個(gè) TPK 家族鉀通道基因——NtTPK1 和NtTPK2。對(duì) NtTPK1 的研究多集中于體外電生理功能上:該基因在普通煙草栽培種 Nicotiana tabacum cv. SR1 中存在 4 個(gè)異構(gòu)體；同 TPK 家族其他蛋白一樣,該蛋白定位與液泡膜,對(duì) K+有極強(qiáng)的選擇性,部分異構(gòu)體在鹽脅迫和高滲透壓的脅迫誘導(dǎo)后表達(dá)量提高[11]。NtTPK2 來(lái)源于普通煙草紅花大金元,在花、葉、莖和根中均有表達(dá)。兩類(lèi)基因在煙草鉀生理代謝過(guò)程中的作用尚待解析[12]。

2 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體

鉀 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 分 為 KUP/HAK/KT 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 、HKT/TrK 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 、 CHX 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 和 KEA 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體 四 類(lèi)[13]。KUP/HAK/KT 家族是生物界內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早、數(shù)目最多、功能最豐富的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體家族,在煙草中也開(kāi)展了一定的研究。

目前發(fā)現(xiàn)的首個(gè)煙草鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是 NrHAK1,由郭兆奎等[14](2009)從黃花煙草中克隆得到。該基因可恢復(fù)酵母鉀吸收缺陷型菌株的吸鉀能力,且在煙苗幼根轉(zhuǎn)錄水平最高,表明其與煙草根部的鉀吸收有關(guān)。隨后,魯黎明等[15](2011)在普通煙草中得到 NrHAK1 的同源基因 NtHAK1,該基因在煙草栽培種 K326中過(guò)表達(dá)后,轉(zhuǎn)化株的鉀含量顯著高于野生型,表明其可提高煙株富集鉀的能力[16]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和部分煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息的公開(kāi),利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)和獲得基因成為一種新手段。煙草NtPOT10 是利用該策略獲得的 KUP/HAK/KT 家族的成員之一(該基因原來(lái)被稱(chēng)為 TPK1,序列分析表明該基因與擬南芥的 AtPOT10 和水稻的 HAK12 同源,為避免與文中上述的 TPK 鉀通道家族混淆,稱(chēng)之為NtPOT10)。該基因主要在葉、莖和花中表達(dá),在根中幾乎無(wú)表達(dá),其具體功能還有待確定[17]。宋毓峰等(2014,待發(fā)表)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),對(duì)林煙草和絨毛狀煙草的基因組進(jìn)行分析,獲得了兩物種KUP/HAK/KT 家族所有的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體成員,并對(duì)林煙草中一個(gè)新基因 HAK11 進(jìn)行了表達(dá)、定位等研究。分析表明,林煙草和絨毛狀煙草均含有 19 個(gè)可能的 KUP/HAK/KT 鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體,HAK11 基因在盛花期林煙草的各組織中均有表達(dá),在主根中表達(dá)量最高,側(cè)根次之,葉片中的表達(dá)量最低,蛋白定位于質(zhì)膜,脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄水平變化表明其可能參與葉片響應(yīng)低溫、高溫和低鉀脅迫的應(yīng)對(duì)機(jī)制。

3 鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)調(diào)控蛋白

植物的鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程,除鉀通道和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體的參與外,還涉及眾多的調(diào)控基因[3]。就目前的研究而言,煙草中還未直接鑒定得到新的調(diào)控蛋白,大量工作多以煙草為材料,研究其他物種來(lái)源的基因在鉀營(yíng)養(yǎng)過(guò)程中的作用。因此,發(fā)現(xiàn)和鑒定煙草自身的鉀營(yíng)養(yǎng)相關(guān)調(diào)控基因,解析其調(diào)控機(jī)制,逐步建立相關(guān)調(diào)控手段,是了解煙草鉀吸收積累過(guò)程、改善煙草鉀素含量的重要內(nèi)容。

研究表明,植物利用不同的鈣調(diào)神經(jīng)素 B 亞基蛋白 CBL(calcineurin B-like protein),與其下游的靶激酶 CIPK(CBL-interacting protein kinase)組成的 CBL-CIPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,將感應(yīng)到的信號(hào)層層傳遞,激活或抑制某些基因的表達(dá)水平或蛋白活性,使植物在分子水平上做出相應(yīng)的反應(yīng),從而響應(yīng)高鹽、低鉀、低溫、干旱等非生物逆境脅迫[18-19]。擬南芥通過(guò) CBL1/CBL9-CIPK23-AKT1 路徑響應(yīng)其低鉀脅迫,該路徑也存在于楊樹(shù)等植物中[20]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥 AtCIPK23 轉(zhuǎn)入煙草后,轉(zhuǎn)基因材料的干物質(zhì)積累以及各器官鉀含量明顯高于對(duì)照,且具有較強(qiáng)的根系活力[21],預(yù)示著煙草中極可能也存在類(lèi)似的機(jī)制。

普通煙草 Nt-SYR1 基因編碼一個(gè)質(zhì)膜融合 Qa-SNARE 蛋白。Nt-SYR1 通過(guò)其 C 端的跨膜結(jié)構(gòu)域錨定于質(zhì)膜上。該蛋白被突變或抑制后,K+和 Cl+通道對(duì) ABA 的響應(yīng)也受到抑制,氣孔關(guān)閉受阻,表明 Nt-SYR1可影響包括鉀通道在內(nèi)的一些離子通道的功能[22]。擬南芥無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因(H+-PPase) AVP2 在煙草中過(guò)表達(dá)后,NtHAK1 的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),同時(shí) NKT1 的轉(zhuǎn)錄水平也略有增加,煙葉 K+的含量顯著增加。該研究表明,鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀通道基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)與液泡膜上 H+-PPase 的能力供應(yīng)有關(guān)[23]。披堿草(Elymus dahuricus)中的氫離子焦磷酸化酶基因 EdHP1 轉(zhuǎn)入煙草后,煙草的根系活力、總根體積、總表面積及發(fā)育程度等各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于野生型對(duì)照,而鉀外排速率卻顯著低于對(duì)照,表明 EdHP1 能夠增加植物對(duì)鉀的吸收[24]。

4 問(wèn)題與展望

長(zhǎng)期以來(lái),通過(guò)傳統(tǒng)的栽培手段和措施來(lái)提高煙葉含鉀量及品質(zhì)的研究均未達(dá)到理想效果。煙草鉀營(yíng)養(yǎng)分子機(jī)制研究起步晚而導(dǎo)致理論基礎(chǔ)相對(duì)缺乏這一現(xiàn)狀更加劇了國(guó)內(nèi)煙葉與國(guó)際優(yōu)質(zhì)煙葉品質(zhì)的差異。煙草鉀營(yíng)養(yǎng)研究成為農(nóng)業(yè)科技的重要關(guān)注點(diǎn)之一。隨著其他作物鉀營(yíng)養(yǎng)研究的深入,開(kāi)展基礎(chǔ)理論研究、選育鉀營(yíng)養(yǎng)高效品種以提高煙草自身的鉀營(yíng)養(yǎng)效率這一策略逐漸受到煙草工作者的廣泛認(rèn)可。隨著基因組計(jì)劃的順利實(shí)施,立足于已有的材料資源和數(shù)據(jù)資源,充分借鑒其他作物的研究思路,大力挖掘鉀營(yíng)養(yǎng)高效的基因,解析其功能及調(diào)控路徑,培育鉀營(yíng)養(yǎng)高效的煙草品種,將成為改善我國(guó)煙葉質(zhì)量的重要手段。

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