內皮素1基因rs5370多態性與海南漢族老年腦梗死的關聯性

黃 達 黃志萍 馮清春 胡少敏 曹桂芬 王興文 吳碧瑩 吳 懇 蘇春妮 孫 悅

(海口市第三人民醫院，海南 海口 571100)

高血壓、心臟病、糖尿病、高血脂、高血黏度等因素通過影響血液成分變化及血流動力學變化而導致血栓形成，發生腦梗死，而遺傳因素也是腦梗死發生的重要影響因素之一〔1～3〕。內皮素(ET)是血管收縮性物質，對調節心血管功能、維持基礎血管張力及心血管系統的穩定性具有重要作用。ET-1是迄今為止發現的收縮功能最強的內源性物質，其增高不僅與腦梗死的發病有關，與其發展過程也有密切關系〔4〕。遺傳多態性是影響蛋白質結構及表達水平的重要因素，也是疾病發生的基礎。ET-1存在遺傳多態性，其中rs5370G/T是內皮素前體蛋白198位氨基酸由賴氨酸突變為天冬酰胺的多態位點。本研究擬探討該位點的突變是否與海南漢族老年腦梗死存在關聯。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)對照組：無血緣關系的海南漢族健康個體156例，肝腎功能正常，排除糖尿病、心腦血管疾病、血液病史。對照組中男97例，女59例,年齡>60歲，平均68.7歲。(2)實驗組：海南省漢族腦梗死患者150例，所有病例均經頭部CT掃描確診為腦梗死，并且符合第四屆腦血管病學術會議修訂的“各類腦血管病診斷要點”中相關診斷標準。男92例，女57例，年齡>60歲，平均69.3歲。所有實驗組患者均排除心源性腦栓塞、有嚴重先天性心、肝、腎和造血系統疾病者、合并惡性腫瘤患者。兩組患者年齡、性別比例及體重等一般體征無顯著差異，存在可比性(P>0.05)。

1.2基因多態性的檢測 ①基因組DNA提取：所有入選者采集EDTA抗凝血3 ml，利用北京天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA。②基因序列的獲得及引物設計：從GenBank中獲取人類ET-1編碼基因，并獲得rs5370的位點信息〔TTTCATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA(G/T)CCCTCCAGAGAGCGTTATGTGACCC〕。根據以上信息在rs5370位點兩側設計兩個引物(P1:GTCGGAGACCATGAGAAACAG，P2:TCAGGAACCAGCAGAGGATGC)，引物擴增片段的長度為220 bp。③PCR擴增體系及條件：每管在1×PCR緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)中含模板DNA 0.2 μg,引物各0.2～0.5 μmol/L，4種dNTP各100 μmol/L,Taq DNA聚合酶(北京天根公司產品)1 U，擴增體系為15 μl。PCR循環參數：95℃預變性3 min，之后進行11個循環反應(每個循環包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循環完成后72℃溫育30 s，接著進行24個循環反應(每個循環包括94℃ 15 s，60℃15 s)，循環完成后72℃溫育3 min。④PCR產物的純化:PCR擴增后取3 μl PCR產物用ExoI和FastAP純化。⑤SNP分型：利用延伸引物TTTTTTTTTATGATCCCAAGCTGAAAGGCAA進行延伸反應，取1 μl延伸產物，加8 μl上樣緩沖液，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀進行分型。

1.3統計學方法 采用SPSS16.0軟件基因頻率采用基因計數法計算。頻率比較用χ2檢驗，計量資料用t檢驗。

2 結 果

兩組中均可檢測出GG、GT、TT三種基因型，三種基因型在實驗組中的分布頻率分別為79例(52.7％)、54例(36％)、17例(11.3％)，在對照組中的分布頻率分別為121例(68％)、47例(26.4％)、10例(5.6％)，組間基因型分布頻率存在明顯差異(χ2=8.79，P=0.012)。GG在實驗組中的分布頻率明顯低于對照組(χ2=8.01，P=0.005)，而TT或者GT在組間的分布則無顯著差異 (P>0.05)。等位基因G和T在實驗組的分布頻率分別為212例(70.7％)、88例(29.3％)，在對照組中的分布頻率分別為289例(81.2％)、67例(18.8％)，統計學分析結果顯示組間差異顯著(χ2=9.97，P=0.001)。

3 討 論

ET對心血管系統的穩定性具有重要作用，而目前發現的三類ET中，ET-1被發現收縮功能最強。成熟的ET-1僅有21個氨基酸，是由含有200個氨基酸的巨大前體經加工編輯而來。rs5370是ET前體分子中198位密碼子的多態性位點，該位點若為G則對應的氨基酸為賴氨酸，若為T則對應的是天冬酰胺。Raymond等〔5〕于2013年提出賴氨酸非共價修飾在機體正常生命過程中的重要性，認為該修飾可能與機體的正常生命活動密切相關，而賴氨酸的突變則可能導致疾病的發生。杭麗瑋等〔6〕探討了該位點與高血壓缺血性腦卒中的關系，結果顯示其基因型頻率和等位基因頻率在腦卒中組和對照組之間有統計學差異，基因型頻率的相對風險分析發現，GT+TT基因型患腦卒中的風險是GG基因型的4.855倍。

本研究結果說明，基因型GG可能是海南漢族老年人群心腦血管的保護因素，而等位基因T則可能是海南漢族老年人群腦梗死的易感基因。

4 參考文獻

1Ueda N,Satoh S,Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma〔J〕. The Neurologist,2011;17(1):34-7.

2楊發滿.老年腦梗死患者血栓調節蛋白及IL-6水平〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(18)：4573-4.

3李紅娟,李 慶.腦梗死患者相關危險因素分析〔J〕.中國衛生檢驗雜志,2013;2:487-8,491

4劉靜波.急性腦梗死患者血漿內皮素表達水平的臨床研究〔J〕.中華全科醫學,2013;8:1329-30.

5Moellering RE,Cravatt BF. Functional lysine modification by an intrinsically reactive primary glycolytic metabolite〔J〕．Science，2013;341(6145)：549-53.

6杭麗瑋,周建中,王 珍,等.內皮素-1基因多態性與高血壓缺血性卒中的關系〔J〕.西南大學學報(自然科學版),2009;1：116-21.