埃克替尼誘導人結腸癌Caco-2細胞凋亡及對相關蛋白表達的影響

張秀艷 石國剛 劉秀艷 葛紅娣

(遵化市人民醫院,河北 遵化 064200)

結腸癌5年生存率為62％〔1〕。化療是治療晚期結腸癌的主要手段之一〔2〕。研究表明，65％～70％的結直腸腫瘤組織中表皮生長因子受體(EGFR)過表達，EGFR信號途徑和晚期結直腸癌的進展和轉移有一定關系〔3〕。本文觀察埃克替尼誘導結腸癌細胞Caco-2的凋亡及對相關凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的影響，旨在進一步觀察EGFR對結腸癌及其相關影響機制。

1 材料和方法

1.1材料 Caco-2細胞株(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)；培養于含有10％胎牛血清、10 g/L非必需氨基酸、10 g/L谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液的(DMEM)完全培養基,在37℃、5％ CO2條件下進行培養, 3 d可基本融合。將Caco-2細胞接種于Transwell板上(孔徑0.8 μm), 接種密度為1×104/cm2, 隔天換液；胎牛血清(Gibco, 美國)；Transwell培養板(Cornig,美國), GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；核轉錄因子(NF)-κBp65抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法 四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖變化，調節Caco-2細胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養板中，每組設6個復孔，每孔加入 MTT 溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，輕輕吸棄培養液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，選擇490 nm 波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光密度(OD)值，細胞抑制率=〔(空白對照組 OD 值-各實驗組 OD 值)/空白對照組OD值〕× 100％。

1.3結腸癌Caco-2細胞凋亡的檢測 收集埃克替尼作用24、48、72 h及空白對照組的細胞 ,調整細胞密度為1×107個/ml,取25 μl的細胞懸液同1 μl的AO/EB染液混勻，吸取10 μl的混合液置于一潔凈的載玻片上 ,蓋玻片封片后 ,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4Western印跡檢測NF-κBp65蛋白水平的表達 收集各組細胞，加裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清測定濃度后-80℃保存備用。SDS-PAGE電泳分離，完畢后將蛋白轉移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉，后放入含一抗的TBST溶液，4℃過夜，洗膜，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫反應1 h，目標蛋白質用DAB顯色。計算機掃描，以GAPDH蛋白做參照，分析處理。

1.5統計學分析 采用SPSS13.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1埃克替尼對結腸癌Caco-2細胞生長的抑制情況 隨著埃克替尼對結腸癌Caco-2細胞作用濃度的增加和時間延長，結腸癌Caco-2細胞生長均受到抑制，并呈劑量和時間依賴性(P<0.05)。24、48、72 h埃克替尼抑制結腸癌Caco-2細胞的IC50值分別為(98.7±9.6)μmol/L,(73.5±6.8)μmol/L和(68.2±5.9)μmol/L，差別有統計學意義(F=44.864 ,P=0.000)。

2.2埃克替尼對結腸癌Caco-2細胞凋亡的影響 10 μmol/L埃克替尼作用24、48、72 h的結腸癌Caco-2細胞凋亡率分別為(8.95±1.11)％，(13.90±1.34)％和(15.4±1.67)％，作用48 h后早期凋亡細胞開始減少，而晚期凋亡和壞死細胞上升，表明埃克替尼對結腸癌Caco-2細胞作用通過早期誘導細胞凋亡繼而導致細胞壞死。

2.3Western印跡檢測 Icotinib處理組PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8出現裂解片段，且隨著Icotinib劑量的增加，裂解片段亦增加，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

結腸癌一般均采用外科手術作為有效的治療手段。大部分結腸癌由于其癥狀的不典型和隱匿性，導致大多數患者在確診時已處于晚期，失去了手術治療的機會〔4〕。靶向藥物是針對靶點的治療，即使是不同病理類型的腫瘤，只要存在相應的靶點，均可能有效；EGFR在多數上皮來源的腫瘤中均有強弱不同的表達，在結直腸腫瘤中均呈過度表達 , 參與了結直腸癌的發生、發展和轉移〔5〕。EGFR 一直是腫瘤治療的熱點，因此發展了多種抗EGFR治療的藥物，包括單克隆抗體- 西妥昔單抗和小分子酪氨酸激酶抑制劑埃克替尼〔6〕。Icotinib是一種口服的EGFR-TKI，主要通過競爭三磷酸腺苷(ATP)結合位點抑制EGFR二聚體的磷酸化，關閉下游信號通路的活化。

本研究結果證實埃克替尼通過誘導結腸癌Caco-2細胞的凋亡發揮其抗腫瘤作用。腫瘤的增生主要取決于細胞的增生和凋亡引起的細胞死亡〔6〕。凋亡機制的減弱或障礙可導致腫瘤的發生，同樣，通過誘導細胞凋亡對腫瘤的消除起到一定的積極作用。在細胞死亡途徑中，首先激活的是啟動型Caspase，如Caspase-8 Caspase-9，而后通過級聯放大過程激活執行型Caspase，如Caspase-3 Caspase-7等，最終特異性地裂解其底物即聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，使 細 胞 發 生 生化及形態學改變，導致細胞凋亡〔7〕。埃克替尼處理組顯著誘導PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解。本實驗證實，埃克替尼通過促進PARP蛋白Caspase-3和Caspase-8的活化裂解，誘導結腸癌Caco-2細胞的凋亡，從而發揮其抗腫瘤作用。

4 參考文獻

1Jemal A, Siegel R, Ward E,etal.A study on alkaline heat treated MgCa alloy for the control of the biocorrosion rate〔J〕.Acta Biomater,2009；5(7):2790-9.

2Sileri P，Dugo S，Bennavoli D，etal.Metachronous splenicmetastasis from colonic carcinoma five years after surgery：a case report and literature review〔J〕.South Med J，2009；102(7)：733-5.

3Abdelall HS, Mishriky AM, Mohamed FA,etal.Epidermal growth factor receptor in colorectal carcinoma: correlation with clinical pathological prognostic factors〔J〕.Colorectal Dis, 2008；10(2):170-8.

4Skvortsov S,Sarq B,Lindner H,etal.Cetuximab inhibits thymidylate synthase in colorectal cells expressing epidermal growth factor receptor〔J〕.Proteomics Clin Appl, 2008；2(6):908-14.

5徐 玲，張 晗，曲秀娟,等.埃克替尼提高胃癌細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的敏感性〔J〕.現代腫瘤醫學,2013;6(21):1174-7.

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7Munoz-Pinedo C.Signaling pathways that regulate life and cell death: evolution of apoptosis in the context of self -defense〔J〕.Adv Exp Med Biol，2012;738(1):124-43.