五味子多糖誘導裸鼠膠質瘤細胞凋亡過程中Caspase-3的表達

唐澤波 溫 娜 張 宇 劉興吉 金 宏 齊 玲 于洪泉

(吉林醫藥學院后勤管理處，吉林 吉林 132013)

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，惡性程度高，約占顱內腫瘤的45%〔1〕。如何有效控制甚至治愈膠質瘤仍是亟待解決的難題。五味子多糖(CPSC)是從五味子成熟干燥果實中提取的含有五味子總多糖、17種以上氨基酸和16種以上微量元素的混合物，具有抗腫瘤活性〔2～8〕，但其具體的抗腫瘤作用機制尚不清楚。本課題組前期研究發現CPSC可以抑制膠質瘤細胞的生長〔9〕。本文進一步研究CPSC對體外培養裸鼠膠質瘤細胞誘導其凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 裸鼠膠質瘤細胞本實驗室提取；五味子多糖(北華大學提供)；細胞培養基RPMI-1640(Thermo公司)，小牛血清和0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(北京中杉公司)。

1.2提取原代裸鼠膠質瘤細胞 留取新鮮的裸鼠腦膠質瘤組織，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后將組織剪成碎塊，置于10 ml離心管中，并加入木瓜蛋白酶放于37℃培養箱中消化30 min，吸取上清液，加血清終止消化，以300 r/min離心5 min后棄上清，加培養液反復吹打，過濾后以300 r/min速度離心5 min，離心棄上清，加入含10%血清培養液培養，臺盼藍計數活細胞，以2×106/75 cm2密度將細胞接種于培養瓶中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養12 h待用。

1.3ELISA法測定裸鼠膠質瘤細胞培養上清中Caspase-3蛋白表達 將裸鼠腦腫瘤細胞以1×106/ml密度接種于24孔培養板中，實驗分為對照組(不含藥物)和CPSC組(0、200、400、800 μg/ml)，作用48 h，每組設5個復孔。取細胞培養上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入Caspase-3抗體(1∶500稀釋)于4℃過夜。加入二抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育2 h，加顯色液室溫避光顯色。于自動酶標儀492 nm處測定A值。

1.4細胞免疫組織化學法檢測Caspase-3蛋白在裸鼠膠質瘤細胞的陽性表達率 按上述方法和分組用不同劑量CPSC作用細胞48 h后，吸出培養上清，取出玻片，10%甲醛溶液固定30 min，空氣干燥；滅活內源性過氧化物酶；一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封片。鏡下觀察，以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性著色，按照公式計算Caspase-3蛋白表達陽性率。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1CPSC對體外培養裸鼠膠質瘤細胞上清中Caspase-3蛋白表達水平 不同濃度(0、200、400、800 μg/ml)CPSC作用裸鼠膠質瘤細胞48 h后，其培養上清中Caspase-3蛋白表達水平均升高(0.79±0.02、0.86±0.01、0.91±0.01)，與對照組(0.71±0.01)比較有統計學意義(P<0.01)。

2.2細胞免疫組織化學法檢測各組裸鼠膠質瘤細胞Caspase-3陽性表達率 CPSC作用裸鼠膠質瘤細胞48 h后，與對照組(26.42%±6.06%)比較，200、400和800 μg/ml多糖組Caspase-3表達陽性率(44.78%±6.58%、58.98%±3.32%、73.33%±5.12%)均明顯升高(P<0.01)。

3 討 論

腦膠質瘤目前治療方案仍然是手術切除輔以放療和化療等綜合治療為主。誘導或促進腫瘤細胞凋亡是冶療腫瘤的基本方法之一。

細胞凋亡是級聯式基因表達的結果，可以通過多種形式誘導凋亡發生。在細胞凋亡的機制研究中提出了兩條主要信號途徑，線粒體途徑和死亡受體途徑〔9〕。Caspases是凋亡信號轉導的共同通路，許多調控細胞凋亡的因素都通過Caspases酶系起作用，其中Caspases-3是該家族中最關鍵的效應分子，負責對凋亡途徑最后執行階段的全部或部分關鍵性蛋白的酶切，被稱為凋亡的執行者〔6〕。當細胞接受凋亡信息時，經過一系列反應激活Caspases-3，活化的Caspases-3通過激活、破壞某些酶，或破壞細胞骨架蛋白等方式，最終導致特征性DNA斷裂，從而介導腫瘤細胞發生凋亡。CPSC是否能通過激活Caspases-3而實現抗膠質瘤作用目前報道不多。本研究結果說明CPSC可能是通過上調Caspase-3蛋白激活了線粒體信號傳導路徑，引起細胞凋亡，從而使裸鼠膠質瘤細胞發生凋亡。

4 參考文獻

1師 蔚，郭振宇.腦膠質瘤發病機制、診斷與治療的研究進展〔J〕.中華神經醫學雜志,2007；6(9):869-71.

2黃 玲，陳 玲，陳振林.五味子多糖對荷瘤鼠瘤體抑制作用的病理學觀察〔J〕.中藥材，2004；27(3):202-3.

3王艷杰，吳勃巖，孫 陽，等.五味子多糖對H22、S180荷瘤小鼠抑制作用的實驗研究〔J〕.中醫藥信息，2007；24(5):64-5.

4于 赫，李 冀，齊 彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學機理初探〔J〕.中醫藥信息,2010；27(2):26-7.

5許珂玉，肖建英.五味子多糖對甲狀腺癌細胞株SW579凋亡及survivin表達的影響〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2011；37(2):279-83.

6甘 露.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長及免疫功能的調節作用〔J〕.免疫學雜志,2013；10(29):867-70.

7Hengartner MO.The biochemistry of apoptosis〔J〕.Nature,2000;407(12):770-6.

8Movsesyan VA,Stoica BA,Yakovlev AG,etal.Anandamide induced cell death in primary neuronal cultures role of calpain and caspase pathways[J].Cell Death Differ,2004；11(10):1121-32.

9溫 娜，唐澤波，袁 瑞，等.五味子粗多糖對腦膠質瘤細胞生長的作用〔J〕.中國老年學雜志，2013；32(12)：2837-8.