外源性促紅細胞生成素對大鼠肺缺血再灌注組織AQP 1表達的影響

朱登彥 張 巖 李向楠 趙 佳 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科,河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州大學腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點實驗室，河南 鄭州 450052)

促紅細胞生成素(EPO)是一種調節紅細胞生成的糖蛋白類激素，其基本生理功能是刺激骨髓紅細胞的生成和釋放。目前臨床上主要用EPO治療腎性貧血及腫瘤等各種慢性疾患所伴發的貧血。近年來的研究發現，EPO對肺缺血再灌注具有保護作用〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一組可調節水分子進出細胞膜的同源蛋白質，AQP 1的異常表達是肺缺血再灌注損傷的原因之一〔2〕。本實驗研究外源性EPO對大鼠肺缺血再灌注損傷后AQP 1表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物及主要試劑 60只河南省實驗動物中心提供的SPF級健康Wistar大鼠，雌雄不限，體重250～300 g。重組人EPO(rhEPO，江蘇宏泰生物工程制品廠)，戊巴比妥鈉注射液(上海劑三廠)、抗AQP 1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。Trizol試劑購自Invitrogen公司，AMV第1鏈合成試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司，PCR試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物模型建立 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素(100 U/kg)。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動物呼吸機行機械通氣(吸入室內空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側肺通氣8～10 ml/kg，雙側肺通氣15～20 ml/kg，吸呼比為1∶2)，經胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷右肺下韌帶，游離右肺門，下穿手術線，于呼氣末結扎右肺門(右主支氣管，右肺動、靜脈)，夾閉45 min后開放120 min，制成在體肺缺血再灌注模型。

1.3實驗分組 60只大鼠隨機分為三組，每組20只。假手術組：開胸游離右肺門，無其他特殊處理。缺血再灌注組:開胸游離右肺門后，夾閉肺門阻斷45 min，再灌注120 min。EPO干預組:于術前2 h腹腔注射rhEPO(5000U/kg)〔3〕，余處理同缺血再灌注組。各組于再灌注120 min時采集標本。

1.4檢測指標 取部分右肺組織，濾紙吸干表面水分，測濕重，然后置70℃熱風烘干箱烘干至恒重后測干重，肺水含量=(肺濕質量-肺干質量)/肺濕質量。取右肺中葉約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小組織塊，用10%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。余右肺組織剪切成黃豆大小的塊并迅速放入液氮罐，然后轉入-80℃冰箱保存，采用RT-PCR方法檢測肺組織中AQP 1 mRNA，采用免疫印跡方法測肺組織AQP 1蛋白。

1.5大鼠肺組織中AQP 1蛋白的檢測 用蛋白裂解液提取組織蛋白質，用考馬斯亮藍標準曲線法測定蛋白質濃度。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量50 μg，常規電泳、轉膜、封閉，加入按1∶200稀釋的一抗，4℃下孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋度為1∶10 000)，置于37℃下孵育1 h，以增強型化學發光試劑(ECL)處理后，在暗室內曝光X線膠片，圖像用Total Lab軟件(2.0版)進行灰度分析。

1.6大鼠肺組織中AQP 1 mRNA表達的檢測 取肺組織，應用Trizol試劑提取肺組織總RNA。取總RNA 2 μg，行逆轉錄。PCR擴增AQP 1，以β-actin為內參，每個樣本重復3次。AQP 1的上游引物為5'-TCCTGCGAGCCGTCCTGTA-3'，下游引物為5'-GGTTGTTGAAGTTGTGGGTGAG-3'，長度為354 bp。PCR反應條件為：以94℃預變性5 min、94℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃延伸1 min為1個循環，共計28個循環，再72℃延伸5 min，最后降至4℃結束反應。PCR產物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，采用凝膠成像系統記錄分析，結果以相對吸光度值(A值)表示。

2 結 果

2.1大鼠肺組織AQP 1 mRNA及AQP 1蛋白的表達 AQP 1 mRNA在三組肺組織的平均相對A值分別為 0.80±0.04、0.49±0.02、1.1±0.02;免疫印跡三組肺組織AQP 1蛋白表達的相對灰度分別為0.45±0.03、0.30±0.04、0.57±0.02。AQP 1 mRNA及蛋白表達水平再灌注組較假手術組降低，干預組較再灌注組、假手術組增高(P<0.05)。

2.2大鼠肺肺水含量比較 肺水含量假手術、再灌注、干預組分別為0.65±0.03、0.93±0.02、0.74±0.04。再灌注組、干預組較假手術組增高，干預組較再灌注組低(P<0.05)。

2.3鏡下病理 假手術組肺泡腔完整，肺泡間隔均勻一致，無明顯充血、水腫。再灌注組肺間質毛細血管充血，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內可見血細胞滲出及滲液積聚。干預組肺泡壁略厚，間質毛細血管充血程度降低，肺泡腔出血、滲出程度與再灌注組比較明顯減輕。

3 討 論

肺缺血再灌注損傷是一個比較常見及重要的病理生理過程，指肺組織經歷一定時間的缺血后再給予恢復血供，缺血性損傷沒有減輕反而加重的病理現象。臨床主要表現為逐漸加重的低氧血癥、肺順應性進行性下降及肺間質水腫等。AQPs 是一組與水通透性有關的同源蛋白質大家族的總稱，AQPs 通過肺泡上皮促進水轉運，無論生理或病理狀態下均對呼吸系統的水平衡起到重要作用〔4〕。研究發現，大鼠肺組織AQP l 主要表達在肺毛細血管內皮細胞，在大鼠肺缺血再灌注損傷過程中，AQP 1 蛋白及mRNA 表達顯著下降，提示肺水腫的形成與AQP 1表達降低有關〔2〕。

EPO是一種主要由腎臟分泌的刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，臨床主要應用于治療貧血。隨著研究的深入，其廣泛的細胞保護作用也日益得到關注。在心臟和腎臟的缺血再灌注損傷中，EPO 表現出很強的器官保護作用〔5〕。國內外研究顯示：EPO 主要通過與細胞膜上EPO受體結合，激活胞質內受體相關的蛋白酪氨酸激酶，引起EPO受體胞內段酪氨酸殘基磷酸化及胞質內一系列蛋白激酶的游走和活化，通過激活多條信號轉導機制，從而發揮器官保護作用〔6〕。

本研究發現大鼠缺血再灌注后肺組織的肺水含量增大，同時AQP 1的表達量較正常組織下降，出現明顯的肺水腫，說明AQP 1的表達減少與肺水腫的形成有關，AQP 1參與了大鼠肺缺血再灌注損傷水平衡的調節。外源性EPO使大鼠AQP 1 mRNA及蛋白表達水平較缺血再灌注組增加，肺水含量下降，肺水腫減輕，提示給予外源性EPO可通過增加AQP 1的表達，促進增多的水腫液回流入血管系統，從而減輕肺水腫，對大鼠肺缺血再灌注損傷起到保護作用。

4 參考文獻

1Moeini M,Nematbakhsh M,Fazilati M,etal. Protective role of recombinant human erythropoietin in kidney and lung injury following renal bilateral ischemia-reperfusion in rat model〔J〕. Int J Prev Med,2013;4(6): 648-55.

2Li XN,Yang JY,Pan X,etal. Influence of extract of Ginkgo biloba leaves tablets on the aquaporin-1 expression in isolated lung ischemia reperfusion〔J〕. Chin Med J,2013;126(24): 4720-3.

3Wu H,Ren B,Zhu J,etal. Pretreatment with recombined human erythropoietin attenuates ischemia-reperfusion-induced lung injury in rats〔J〕. Eur J Cardiothorac Surg,2006;29(6): 902-7.

4Perez Di Giorgio J,Soto G,Alleva K,etal.Prediction of aquaporin function by integrating evolutionary and functional analyses〔J〕. J Membr Biol,2014;247(2): 107-25.

5Li XJ,Zhang GX,Sun N,etal.Protective effects of erythropoietin on endotoxin-related organ injury in rats〔J〕. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci,2013;33(5):680-6.

6Miyake M,Goodison S,Lawton A,etal. Erythropoietin is a JAK2 and ERK1/2 effector that can promote renal tumor cell proliferation under hypoxic conditions〔J〕. J Hematol Oncol,2013;6(1):65.