高遷移族率蛋白B1活化肝星狀細胞在肝纖維化中的作用

田小星 孫 航

(重慶醫科大學附屬二院病毒性肝炎所，重慶 400010)

肝星狀細胞(HSCs)是導致肝纖維化的主要效應細胞，HSCs的活化啟動、增殖、合成細胞外基質(ECM)是肝纖維化發生發展的中心環節〔1〕。HSCs激活和增殖受到多種細胞因子網絡調控。在眾多的細胞因子中，高遷移族率蛋白(HMG)B1在胞外作為損傷相關分子模式(DAMPs)成員之一具有強大的致炎細胞因子活性〔2〕。一方面，HMGB1作為晚期炎癥介質成為慢性炎癥持續存在維持HSCs持久化激活的基礎；另一方面，細胞外的HMGB1通過多種信號通路，放大炎癥效應造成炎癥反應失控遷延〔3，4〕，參與肝纖維化的發生、發展。本文對HMGB1通過HSCs引起肝纖維化的研究進行綜述。

1 HMGB1理化及生物學性質

HMGB1屬于HMG家族成員之一，是一類核蛋白，約30 kD，因其分子質量小，在聚丙烯酰胺凝膠電泳時速度快而得名。HMGB1廣泛分布于淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織細胞中，在肝、腦組織中主要存在于胞質，而在大多數組織中存在于胞核，進化上高度保守。人類HMGB1基因位于13q12染色體上，包括4個內含子及5個外顯子，基因序列中包含TATA盒啟動子及數個轉錄因子結合位點。人HMGB1含有215個氨基酸，含有2個功能同源的L型結構域，即A box(9～85氨基酸)、B box(88～162氨基酸)及一個高酸性的重復C末端(186～215氨基酸)構成。其中B box是HMGB1誘導細胞因子產生的部分，活性區位于前20個氨基酸殘基，而A box對B box有一定的拮抗作用。HMGB1在細胞內外功能各異，胞內作為“DNA伴侶”，參與了穩定染色質結構、細胞分化成熟、DNA修復及重組、類固醇激素調控及基因轉錄調控等重大生命活動。HMGB1還出現在胞質，作為細胞因子樣分子行駛功能。HMGB1除由激活的巨噬細胞、成熟的樹突細胞組(mDC)及自然殺傷(NK)細胞主動分泌外，還可由壞死細胞被動釋放至細胞外，招募炎癥細胞，促使產生炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6等，激活內皮細胞，在啟動、促進炎癥反應中起著重要作用〔5〕。壞死細胞由于HMGB1與染色體解離游離釋放到細胞外，但在程序性細胞死亡即凋亡過程中，染色體不發生乙?；?，HMGB1不與染色體分離，從而HMGB1不釋放到細胞外。早期研究認為HMGB1缺少信號肽，不能像傳統的細胞因子通過高爾基體及內質網，而是以一種非典型的囊泡方式釋放，但目前研究表明，HMGB1通過經典型蛋白激酶C途徑發生磷酸化以鈣依賴機制分泌到胞外〔6〕。

2 HSCs與肝纖維化

HSCs是一種肝臟的非實質細胞，占肝細胞總量的5%～10%，主要分布于Disse間隙內，其正常生理功能與脂肪存儲及維生素A代謝有關，增殖活性和合成膠原能力低，不表達α-平滑肌動蛋白(α-SMA)。持續的炎癥反應通過激活機體固有免疫系統，導致細胞免疫反應異常，引起機體持續釋放大量炎性細胞因子〔TNF-α、轉化生長因子(TGF)-β、IL-6、IL-1、血小板衍生生長因子(PDGF)等〕，一方面造成肝細胞持續性損傷，損傷的肝細胞進一步釋放炎癥性細胞因子和可溶性介質；另一方面激活各種致纖維化通路〔TGF-131、人結締組織生長因子(CTGF)、有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等〕活化HSCs，活化的HSCs增殖，轉變為表達α-SMA的肌成纖維細胞(MBF)，大量合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)，使ECM合成增多，降解減少，最終導致ECM積聚而發生肝纖維化乃至肝硬化〔7〕。因此，HSCs的激活、增殖并大量產生ECM是肝纖維化發生發展的中心環節，而HSCs激活過程包括早期啟動激活和后期的“持久化”激活，并且激活的“持久化”是維持HSCs處于激活狀態并增殖、持續產生ECM引起肝纖維化和肝硬化的必要條件。

3 HMGB1介導持續炎癥反應維持HSCs持久激活

細胞因子在HSCs的激活、增殖和產生ECM中起著十分關鍵的作用，其中HMGB1作為晚期炎癥介質，因其出現晚、持續時間長的特點，具有維持和放大炎癥反應的作用，成為肝纖維化中HSCs激活“持久化”的基礎，并與膿毒癥、關節炎、肝炎等發病關系密切。在受試小鼠腹腔注射LPS后8 h，可檢出血清HMGB1于16～32 h到達并維持峰值濃度〔8〕，此時TNF峰已過，表明HMGB1作為晚期炎癥介質參與炎癥反應并且持續時間較長，成為“持久化”的基礎。采集外周血單核細胞，用重組HMGB1(rHMGB1)刺激，可顯著釋放TNF、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、分子印跡聚合物(MIP)-1α、MIP-1β；且HMGB1與LPS相比，HMGB1誘導TNF合成具有延遲及雙向性，即HMGB1刺激后，TNF釋放在3 h出現一高峰后，又在8～10 h出現另一更高峰，而單獨予LPS刺激TNF釋放僅在1 h產生高峰；予小鼠亞致死量rHMGB1于6 h內可引起血清中TNF-α的釋放。表明HMGB1刺激可促進炎細胞活化及促炎細胞因子的產生和分泌〔9，10〕，維持放大炎癥反應，持續活化HSCs；同時HMGB1可通過上調血管內皮細胞表面細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管細胞黏附分子(VCAM)-1的表達，增加黏附作用并刺激血管內皮細胞釋放TNF-α、IL-8和MCP-1增強局部炎癥環境，持續活化HSCs。HMGB1還通過與其他促炎因子正反饋效應在炎癥后期對炎癥反應起維持作用，激活T淋巴細胞通過死亡配體和受體相互結合誘導肝細胞凋亡，淋巴細胞進一步激活巨噬細胞，導致多種炎癥細胞因子釋放，產生細胞死亡級聯反應，介導肝損傷〔11〕，使得炎癥反應持續并活化HSCs。此外，Mouri等〔12〕研究報道，胞內HMGB1協同單核-巨噬細胞所特有的Ets轉錄因子家族成員之-PU.1，反式作用于人類IL-1β基因的啟動子，在胞內通過活化IL-1β轉錄放大炎癥反應，持續活化HSCs。

4 HMGB1活化HSCs的可能分子機制

HMGB1可能是肝纖維化中HSCs持續活化的關鍵細胞因子，但其活化HSCs的機制尚未闡明。細胞外HMGB1通過與相應的細胞膜受體如晚期糖基化受體(RAGE )和Toll樣受體(TLRs)結合，由胞內信號傳導而發揮生物學效應。HSCs表面可表達TLR2、TLR4，有學者報道慢性肝炎患者中HMGB1 mRNA 水平顯著高于正常人〔13〕，韓紅莉等〔14〕研究顯示肝纖維化模型中HMGB1在纖維間隔區域，變性壞死區及炎細胞聚集區有陽性表達，提示HMGB1是肝纖維化發生發展的直接或間接關鍵因子。因此推測HMGB1與HSCs表面的TLR2、TLR4結合后，激活細胞內的NF-κB和MAPK信號傳導通路，活化HSCs的主要途徑為以下2條：①NF-κB信號通路：HMGB1與HSCs表面的TLR2、TLR4受體結合，可激活MyD88-IRAKs-TRAF6-NF-κB 這一信號通路，最終使得磷酸化；②MAPK信號通路：HMGB1與HSCs表面的TLR2、 TLR4受體結合，可以激活MAPK家族中三種重要的信號通路亞類，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、胞外信號調節激酶1和2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)〔15〕。MAPK信號通路的激活，最終導致激活蛋白(AP)-1活化。NF-κB和AP-1活化后轉位進入細胞核，調控纖維化相關基因轉錄，從而活化HSCs，促進HSCs增殖，合成大量的ECM，并使基質金屬蛋白酶(MMPs)合成減少，TIMP-1、TIMP-2合成增加，導致ECM降解下降，最終導致ECM積聚而發生肝纖維化乃至肝硬化〔16，17〕。此外，TGF-β是肝纖維化中重要的細胞因子之一，在肝纖維化中的主要作用是促進ECM的合成及降解，也有間接促進HSCs的增殖作用，TGF-β還抑制MMPs及TIMPs等的生成使ECM降解減少。同時TGF-β構成活化HSCs的自分泌循環。HMGB1與TRL4結合后，促進HSCs增殖并自分泌TGF-β，分泌的TGF-β又可上調HMGB1表達，形成HMGB1與HSCs自分泌TGF-β相互作用，加重肝纖維化發生發展〔18〕。

5 總結與展望

長期以來，肝纖維化被認為是慢性炎癥的結果，眾多細胞因子形成了一個促纖維化的微環境，促進一系列基因的轉錄，使HSCs激活并持續活化，導致ECM在組織器官生成和大量沉積導致肝纖維化發生發展乃至成為肝硬化。眾多細胞因子中，HMGB1在細胞因子網絡中具有核心作用，一方面作為早期啟動因子從壞死細胞中被動釋放，還可作為晚期炎癥介質從巨噬細胞主動釋放維持慢性炎癥反應持續活化HSCs；另一方面細胞外的HMGB1與其配體晚期糖基化終產物受體(RAGE)和Toll樣受體結合，激活細胞內信號轉導通路，活化NF-κB和MAPK通路，進一步促進各種炎性細胞因子的釋放，放大炎癥效應；而被誘生的炎性細胞因子反過來又促進HMGB1產生與釋放，形成正反饋協同效應，造成炎癥反應失控遷延，持續活化HSCs，促進肝纖維化發生發展。

由于HMGB1具有炎性介質和致炎細胞因子的特殊動力學特點，拮抗HMGB1在治療膿毒癥、重癥急性胰腺炎等急慢性炎性疾病中成為熱點〔19，20〕，但尚無報道其用于抗肝纖維化治療。探討HMGB1引起HSCs持續活化逐漸受到重視，有望成為抗纖維化治療的靶點。但HMGB1不同受體及信號轉導途徑的區別及其相關機制，HMGB1拮抗劑的安全性及實用性有待進一步探索。

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