骨質疏松癥動物模型的制作與評價＊

付小衛，宋長恒，劉梅潔，于 崢，趙宏艷，張治國，張方珍，李岳澤

(1.陜西中醫學院第二臨床醫學院，陜西咸陽 712046;2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少或(和)骨組織微結構破壞為特征的全身性骨骼疾病，表現為骨強度下降、骨脆性增加，從而極易發生骨折。骨質疏松癥及由其引起的骨折等并發癥，對中老年人尤其是絕經后婦女的身體健康和生存質量構成了嚴重威脅，并極大地增加了社會和家庭的經濟和生活負擔。近20多年來，中醫藥工作者在大量臨床實踐經驗的基礎上，開展了廣泛的防治骨質疏松癥的實驗研究工作，取得了較大的研究成果。本文簡述中醫藥科研中各種骨質疏松癥動物模型的制作方法并進行評價。

1 去勢法

去勢法分為雌性去卵巢法和雄性去睪丸法。

1.1 去卵巢法

此法是20世紀60年代末由Saville利用實驗大鼠首次建立的［1］，目前已成為研究絕經后骨質疏松癥的經典模型之一。大鼠雙側卵巢切除后的骨丟失，與婦女絕經或卵巢切除后的骨丟失極為相似，都是由于體內雌激素水平迅速降低，使其對成骨細胞的促成熟功能和對破骨細胞的抑制功能減弱，使骨代謝呈現負平衡，即骨吸收和骨形成都明顯增加，但骨吸收功能大于骨形成功能，以骨丟失為主，進而啟動了骨的合成，屬高轉換型骨質疏松。

鄺志強等［2］用6月齡雌性SD大鼠切除雙側卵巢8周后進行干預，干預12周后采用雙能X線檢測大鼠BMD，ELISA法檢測血清 RANKL、OPG含量，real-time PCR檢測大鼠骨組織RANKL、OPGmRNA表達。實驗結果顯示，與sham組比較，OVX組大鼠BMD降低，血清RANKL含量增加，OPG降低，骨組織RANKL mRNA表達增加，OPG mRNA表達減少。

1.2 去睪丸法

去睪丸大鼠骨質疏松動物模型是研究男性骨質疏松的重要工具。大量臨床資料證實，成年男性手術或藥物去勢造成的雄激素迅速降低，致使骨轉換增加骨量丟失，而激素替代療法可以逆轉這一狀況。雄激素具有抑制骨吸收促進骨形成的作用，主要是通過直接作用于成骨細胞上的雄激素受體和經芳香化酶作用轉變為雌二醇發揮作用。另外，雄激素缺乏也可減少降鈣素的分泌量，進而間接引起破骨細胞活性增加。

蘇開鑫等［3］對4月齡SD雄性大鼠切除睪丸90 d后觀察發現，去睪丸組大鼠脛骨上端骨量下降，骨形成和骨吸收參數都增加，骨代謝呈高轉換型，同時腰椎也出現骨質丟失。

近年的研究也表明，雌激素在維持男性骨代謝平衡方面有著重要作用。切除睪丸后造成的骨量減少、骨質疏松，到底是雄激素還是雌激素缺乏引起的，目前觀點尚不一致，有待今后深入研究探析。

2 給藥法

2.1 糖皮質激素

大量臨床資料證實，長期或大量使用糖皮質激素可以引致骨質疏松且并發骨折。其發生機制是超生理劑量的糖皮質激素可顯著抑制松質骨的骨形成，增加骨吸收，使骨代謝呈現負平衡，進而導致OP，常用藥物有地塞米松、潑尼松龍等。趙旭等［4］采用此法造模研究左歸丸治療OP的效應機制，給予SD大鼠地塞米松1 mg/kg肌肉注射，每周2次，連續8周，結果顯示模型組血清堿性磷酸酶升高，腰椎骨生物力學性能下降，股骨骨礦含量、BMD均下降，而中藥左歸丸可對以上指標有逆轉改善作用。

2.2 維A酸

維A酸又稱維甲酸，是體內Vitamin A的代謝中間產物，臨床上主要用于治療腫瘤和銀屑病等，但其有致骨質疏松的副作用。有文獻報道［5］，此藥既有促進成骨細胞增殖和分化作用，又能增加破骨細胞的骨吸收，故而可造成骨形成與骨吸收都活躍的高轉換型OP。西安交通大學許鵬等［6］研究表明，給予維甲酸15 d時模型組大鼠血清雌二醇水平明顯降低，其機制有可能是損傷大鼠卵巢，使雌激素分泌減少，進而減低對破骨細胞的抑制作用，造成骨吸收明顯增強。

2.3 D-半乳糖

1985年，有學者［7］運用其建立衰老模型。后研究發現，D-半乳糖可致雄性大鼠發生骨質疏松，主要機制是其可損害雄性大鼠的睪丸，使雄激素降低。戴娟秀等［8］研究指出，D-半乳糖大量在細胞內堆積可使細胞滲透壓升高、脆性增加，并可產生大量氧自由基，進一步使細胞老化和功能減退，在雄性大鼠實驗中，可使大鼠睪丸支持細胞和生精細胞發生損傷，血清睪酮下降，從而使破骨細胞活性增加，抑制鈣的腸吸收并增加鈣磷排泄，最終導致OP，但D-半乳糖對雌性大鼠不能導致骨質疏松［9］。

2.4 環磷酰胺

環磷酰胺是一種烷化劑，具有明顯的抗癌和免疫抑制作用，臨床多用于惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、淋巴細胞白血病等腫瘤性疾病和變態反應性疾病。其作用機制可能與其免疫抑制作用、促進骨鈣釋放、抑制骨羥脯氨酸的合成及骨鈣的沉積有關，因而此法建立的OP模型具有骨礦物質和骨基質等比例減少的特點。曹勝男等［10］采用此法進行造模研究，給予小鼠此藥20 mg/(kg·d)連續灌胃，2周即可使小鼠骨干重減少，股骨長和橫徑減少，骨礦物質和骨基質同時減少，建立OP模型。

2.5 谷氨酸單鈉

谷氨酸單鈉俗稱味精，是對健康有害的食品添加劑之一。作為一種中樞興奮性神經遞質，大量文獻證實其具有神經毒性作用，給新生期大鼠皮下注射谷氨酸單鈉可損毀下丘腦弓狀核而導致骨質疏松。鐘平等［11］給予新生期SD雌性大鼠皮下注射10%谷氨酸單鈉，4個月后進行骨組織形態計量學檢測，結果顯示實驗組與生理鹽水對照組比較，骨形成減少，骨吸收增加，骨量減少，導致骨質疏松發生。

3 營養干預法

此法主要是控制動物飼料中鈣和蛋白的含量。鈣是骨骼的基本成分，人體中99%的鈣存在于骨骼中。長期的低血鈣可使機體處于負鈣平衡狀態，從而繼發引起甲狀旁腺功能亢進，PTH分泌增多，導致骨量丟失，發生OP。流行病學調查顯示［12］，人群中蛋白質攝入量與骨密度呈顯著負相關，其主要原因是高蛋白攝入使尿中固定酸含量增加，腎近曲小管對鈣的重吸收減少，從而使鈣從尿液中流失增加。

復旦大學王燁明等［13］通過采用對3周齡SD大鼠攝食低鈣高蛋白飼料造模，6個月后實驗組大鼠即出現骨小梁面積減少、變窄、間距增寬、斷裂，骨代謝提示破骨細胞活性顯著增加，成骨細胞功能也變活躍，呈現高轉換骨質疏松。

4 疾病并發癥

4.1 糖尿病性

流行病學調查表明，糖尿病患者易發生骨質疏松。其發生機制主要有胰島素缺乏、糖代謝紊亂、微血管病變3方面，以及胰島素對骨的影響通過直接作用或由生長因子(IGF-1)介導。薛昊罡等［14］研究AGEs對糖尿病大鼠骨質疏松的作用機制，取SD大鼠腹腔內注射STZ，誘導建立糖尿病骨質疏松動物模型，結果顯示模型組大鼠的骨組織形態計量學參數靜態指標和動態指標與對照組比較差異有統計學意義，呈現骨質疏松表現。

4.2 肝硬化性

近年來臨床觀察發現［15］，膽汁瘀積性肝病可并發骨質疏松，其發生機制尚未完全明了，目前認為與肝內膽汁瘀積使腸腔內膽鹽減少，引起維生素D、鈣吸收障礙有關。鄒麗宜等［16］用四氯化碳致小鼠肝纖維化制造肝硬化模型，測定右股骨干重和股骨總鈣含量減少，提示有骨量丟失，同時血清白蛋白明顯減少，球蛋白明顯增加，此骨量丟失或許與蛋白紊亂有某種聯系。

4.3 酒精中毒性

長期過量飲酒所致的酒精中毒可引發骨質疏松，屬于低轉換型骨質疏松癥［17］。酒精可影響骨代謝，使骨吸收增強，骨形成減少、骨量降低而引發OP。任樹軍等［18］給予雄性SD大鼠紅星二鍋頭灌胃法造模，16周后取材行雙能X線骨密度儀檢測左側股骨BMD和BMC，結果二者均明顯低于正常對照組，說明造模成功。

5 制動法

臨床觀察發現，某些疾病患者因為運動受限和功能障礙一段時間后，可出現骨礦含量減少、骨小梁變細，甚至關節疼痛、變形、駝背、脊柱側彎等骨質疏松表現，可稱之為失用性骨質疏松。據此，可以制作OP動物模型用于科學研究，常用的方法有腿-尾固定法、尾掉法、坐骨神經切斷法等。華西醫院唐學陽等［19］通過腿-尾固定法對4周齡SD雄性大鼠進行制動法建立OP模型，制動2周和4周后幼鼠右后肢股骨的濕重和灰重、股骨和脛骨BMD均低于同齡對照組。另外，制動2周時出現右側脛骨骨小梁稀疏，制動4周可見紐扣樣改變，髓腔增大。

6 基因敲除法

基因敲除技術是20世紀80年代創立的一門新技術，是采用一定方式在體外構建載體，通過同源重組的方式刪除1個基因，此基因結構已知功能未知，從而在細胞水平或動物水平觀察研究該基因的功能［20］。上世紀末即有報道［21］，利用骨保護素(OPG)基因敲除純合子小鼠可表現出嚴重的骨質疏松癥。近年來，國內學者也多有運用此法建立OP模型進行研究，如上海中醫藥大學程少丹等［22］采用頻密繁殖法獲得OPG基因敲除小鼠進行骨質疏松研究，發現其表現出明顯的骨質疏松，是一種理想的骨質疏松模型動物。

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