大鼠腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡相關調控因子的研究進展

林海平 王 永 沈 燕 王 舒

(天津中醫藥大學研究生院，天津 300073)

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指腦缺血一定時間再恢復血液供應后，大腦功能不僅沒有得到及時恢復，反而出現更加嚴重的功能活動障礙。缺血再灌注損傷是一種常見、復雜的病理生理過程，其主要的損傷形式是細胞凋亡(apoptosis)。細胞凋亡是指在一定的生理和病理條件下，機體為了維護內外環境的穩定，通過多基因的調控使細胞主動死亡的過程，屬于一種生理性的細胞死亡。

近年來國內外的很多學者從多種角度研究腦缺血再灌注后的細胞凋亡機制，發現多種因素參與細胞凋亡。目前研究認為細胞凋亡主要存在兩種途徑：細胞外的死亡受體途徑和細胞內的線粒體途徑。在缺血性腦血管病中，神經元的細胞凋亡與壞死一樣，對神經元的功能損害具有重要作用〔1〕。細胞凋亡主要發生在缺血程度較輕的半暗影區，是一種涉及多因素調控的復雜的主動死亡過程，其中主要包括：Caspase-3、NF-κB、Bcl-2/Bax等因子的調控。

1 Caspase-3與細胞凋亡

1.1Caspase家族 Caspase家族是一大類凋亡調控因子，最初有學者發現線蟲屬動物的細胞凋亡需要一種名為CED-3的蛋白，這種蛋白和哺乳動物白細胞介素-1轉換酶(ICE)是同源物，因它們均特異性地在P1位點的天冬氨酸殘基后切割底物，所以命名為Caspase。按其分子結構可將Caspase家族分為3大類：I類是ICE亞家族，作用于四肽序列WEHD，主要包括Caspase-1、4、5、11和13；Ⅱ類是CPP32亞家族，最易識別DEXD序列，包括Caspase-2、3、7和10；Ⅲ類是ICE-1亞家族，作用于EXD序列，包括Caspase-6、8和9；其后兩類在細胞凋亡中起重要作用〔2，3〕。

1.2Caspase-3的激活及對細胞凋亡的作用 在Caspase家族中，Caspase-3是Caspase級聯“瀑布下游”最關鍵的凋亡執行蛋白酶,其在正常細胞(包括神經細胞)中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，參與腦缺血再灌注后神經元損傷的病理過程，引起細胞凋亡。研究證明Caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用〔4〕，是細胞凋亡的重要執行者和哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，被稱作是“殺手蛋白”。

研究表明Caspase-3主要通過細胞凋亡的線粒體通路、死亡受體通路和內質網應激通路來介導細胞凋亡〔5～7〕。(1)線粒體通路：當缺血再灌注造成線粒體損傷后，細胞色素C(Cyt-C)作為應激傳感器從線粒體中被誘導釋放到胞質中，在ATP/dATP存在的情況下，Cyt -c能與凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)結合，使Apaf-1構象發生改變繼而寡聚化，接著和procaspase-9 結合形成“凋亡體”，從而激活Caspase-9，活化的Caspase-9又進一步激活下游的Caspase-3等，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡〔8〕。(2)死亡受體通路：腫瘤壞死因子超家族的死亡配體TNF-α和細胞表面的死亡受體FasL/CD95L相結合，使受體三聚化，然后通過DD(death domain)域募集銜接蛋白(如FADD)，銜接蛋白通過死亡效應域(DED)與procaspase-8 形成一個超分子復合物(死亡誘導信號復合物)，然后激活Caspase-8，進而啟動Caspase級聯反應，激活下游的Caspase-3等，引起細胞凋亡。(3)內質網應激通路：內質網中由于鈣平衡的破壞和自由基蓄積引起其壓力的改變，誘導Caspase-12(位于內質網膜)的表達，進而激活下游的Caspase-3，引起細胞凋亡。關于Caspase-3與腦缺血再灌注后細胞凋亡的具體作用機制，多數學者認為，激活后的Caspase-3可裂解細胞內相關酶類,破壞細胞骨架和核骨架，改變細胞形態，介導細胞凋亡。

近年來國內外很多學者都通過實驗證實：大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3表達明顯增強，凋亡細胞明顯增加，二者之間存在明顯的時空相關性〔9，10〕；而通過向大鼠腦室內注射Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk后，發現梗死區細胞凋亡的數量明顯減少〔11〕。這些研究均證明了腦缺血再灌注后Caspase-3的表達及其與腦缺血損傷的密切關系：在腦缺再灌注損傷的Caspase級聯反應中，Caspase-3作為下游凋亡效應因子起著關鍵性作用。

2 核轉錄因子-κB(NF-κB)與細胞凋亡

2.1NF-κB NF-κB首先是由Rwiansen在1986年發現的。他在成熟B細胞和漿細胞中發現一種新的蛋白，能與免疫球蛋白κ輕鏈內含增強子的特異性序列結合，該序列由10個核苷酸組成(5-GGGACTTTCC-3)，故命名為κB，是一種廣泛存在于神經元、神經膠質細胞和血管內皮細胞中的核轉錄因子〔12〕。其家族成員在氨基末端部位均含有一段大約300個氨基酸所組成的保守區，被稱為Rel同源結構域，包含有DNA結合區、二聚體形成區、核定位信號(NLS)、前激肽釋放酶激活劑(PKA)磷酸化區域。根據C-末端的不同，可以將NF-κB家族成員分為兩組：第一組包括P50和P52，分別由其蛋白前體P105和Pl00裂解而來；第二組包括沒有前體的P65/RelA 、RelB 和c-Rel，其中發揮主要生理功能的是由P50-P65所形成的異源二聚體，即我們通常所指的NF-κB。

2.2NF-κB的激活及對細胞凋亡的作用 在靜息狀態下，NF-κB家族形成的二聚體與IκB-α(NF-κB的抑制蛋白)以三聚體的形式存在于胞質中，此時的NF-κB不具有調節基因轉錄的能力〔13〕，當受到激活的蛋白激酶刺激時，IκB-α發生磷酸化,磷酸化后的IκB-α使NF-κB游離于胞漿中，迅速發生核移位，誘導白細胞介素-1、細胞間黏附分子、腫瘤壞死因子-α等的表達和鈣超載、氧自由基的形成，參與細胞凋亡的調控〔14，15〕，這是NF-κB主要激活途徑。此外，酪蛋白激酶2(CK2) 激活后引起IκB-α的C端磷酸化，從而使NF-κB的激活不依賴IκB，而是通過p38絲裂原活化蛋白激酶，因此p38-CK2-IκB-α也是激活NF-κB的途徑之一〔16〕。

NF-κB對細胞凋亡的作用機制主要體現在通過調控一系列凋亡相關因子的表達來實現的。有研究認為腦缺血再灌注可導致細胞內鈣超載、氧自由基形成等，激活內質網應激反應，進而激活NF-κB，活化后的NF-κB則誘導凋亡基因(如TRAIL-1和TRAIL-2 死亡受體)表達上調，最終導致細胞凋亡〔17〕；而NF-κB的活化還可以通過誘導細胞內凋亡抑制蛋白c-IAP1和c-IAP2的表達，上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制線粒體通透性轉換孔的開放，進而阻止Caspase-3，7，9的活化而抑制細胞凋亡。NF-κB還可以通過對其自我吞噬作用的抑制來發揮抗凋亡作用〔18〕。Nijboer等〔19〕則認為NF-κB在細胞凋亡中起雙重作用，早期NF-κB的激活加重腦損傷，而NF-κB的持續激活則能產生內源性神經保護因子，上調抗凋亡因子的表達，抑制細胞凋亡。Crack等〔20〕認為NF-κB對細胞凋亡起促進還是抑制作用主要和NF-κB的產生部位、刺激信號、產生量以及持續時間有關。

NF-κB在細胞凋亡中究竟起何種作用，目前還沒有定論。Peter等〔21〕在實驗中發現腦缺血再灌注后，與野生型老鼠比較，抗氧化劑Gpx1敲除鼠的NF-κB表達含量顯著增加，腦缺血損傷范圍明顯擴大，大腦皮層和紋狀體區域的神經細胞凋亡數量也相應增加，由此推斷腦缺血再灌注后腦區的超氧化狀態引起NF-κB的過表達，促進細胞凋亡。通過抑制IκB-α的降解及磷酸化可以顯著降低NF-κB的活性，從而減輕缺血再灌注所引起的腦組織損傷〔22〕；而Hill等〔23〕在大鼠腦缺血再灌注損傷實驗中發現NF-κB對細胞凋亡起抑制作用。因此NF-κB對細胞凋亡的具體作用還有待進一步的研究。

3 Bcl-2/Bax與細胞凋亡

3.1Bcl-2家族蛋白 Bcl-2作為目前首個被確認有抑制細胞凋亡作用的因子〔24〕，近些年成為腦缺血再灌注損傷的研究熱點之一，其家族成員之間的相互作用對腦缺血再灌注后神經細胞的凋亡起了重要的調節作用。

按其結構和對細胞凋亡的不同作用可將Bcl-2家族分為兩大類：一類為抗凋亡蛋白，主要包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等；另一類為促凋亡蛋白，主要包括Bax、Bak、Bid等。其中Bcl-2和Bax作為Bcl-2家族蛋白的最主要成員，其表達的變化對細胞凋亡起重要的調節作用〔25〕。Bcl-2由239個氨基酸組成，主要位于線粒體膜、內質網和核膜等處，Bax是一種跨膜蛋白，主要存在于細胞內膜、細胞質和細胞核中，與Bcl-2抑制細胞凋亡的作用正好相反，Bax作為Bcl-2家族中最重要的促細胞凋亡因子，能與Bcl-2形成異源二聚體，從而促進細胞凋亡。

3.2Bcl-2/Bax的激活及對細胞凋亡的作用 Bcl-2和Bax作為一組重要的細胞凋亡調節因子，二者在正常狀態下構成一個平衡體系。當細胞受到各種刺激因素作用后，他們的表達就會發生變化，二者的比值決定了細胞是否凋亡：當Bcl-2表達占優時抑制細胞凋亡，Bax表達占優時則促進細胞凋亡〔26〕。當受到凋亡刺激時，Bcl-2與其他家族成員如Bax等通過磷酸化、蛋白水解等方式，最終定位于線粒體膜，通過調節膜的通透性〔27〕，使得Bcl-2能在線粒體膜上通過多種途徑抑制細胞凋亡：(1)Bcl-2蛋白作為線粒體PT孔道的有效組成成分，其高表達后可以阻止Cyt-c等穿過線粒體膜，進而阻止由Cyt-c所引起的凋亡程序(Caspase級聯反應)〔28〕，抑制細胞凋亡。(2)Bcl-2高表達后可以阻止bax/bak的寡聚化，從而抑制Cyt-c和AIF(凋亡介導因子)等重要蛋白的釋放，使細胞免于凋亡〔29〕。(3)Bcl-2還可以調節線粒體巰基的氧化還原狀態，控制其膜電位，阻斷氧化作用對細胞的破壞，改變鈣離子分布，從而激活內源性內切酶，抑制谷胱甘肽(GSH)的外移以降低胞內的氧化還原電位，進而抑制細胞凋亡。此外，Bcl-2還可以將凋亡蛋白前體Apaf-1等定位至線粒體膜上，使其不能發揮凋亡作用從而保護細胞。而 Bax當受到凋亡刺激后，由胞質向線粒體外膜轉位，與膜上的電壓依賴性離子通道結合， 拮抗Bcl-2對線粒體通透性的抑制作用，從而開放線粒體通透轉換孔(MPT)，最終啟動Caspase相關的凋亡級聯反應，促進細胞凋亡〔30〕。綜上所述，Bcl-2/Bax主要通過調節線粒體膜的通透性來調節細胞凋亡，二者通過在線粒體外膜形成離子通道，阻止或促進細胞色素C的釋放，進而調節一系列凋亡因子，完成對細胞凋亡的調節。Hetz〔31〕通過研究發現，腦缺血再灌注后，Bcl-2和Bax之間的平衡狀態被打破，二者表達的比率決定了腦缺血再灌注后細胞凋亡與否：當Bcl-2過表達時抑制細胞凋亡，相反則促進細胞凋亡，并且還發現通過抑制Bax通道活性可以降低缺血再灌注后的細胞凋亡。近期國內外研究同樣證實了Bcl-2和Bax對細胞凋亡的調節作用，與之前的大量研究結果相似：Bcl-2對于腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡的抑制作用十分明顯，其與Bax之間的相互作用以及二者之間表達比值的變化共同決定細胞凋亡與否〔32，33〕。

4 結 語

腦缺血再灌注損傷是一種機制復雜而又臨床常見的病理生理過程，細胞凋亡是其嚴重的損傷形式之一。有學者認為細胞凋亡是涉及多種凋亡相關因子共同表達的結果，同時又受到多種內外因素的調節，如細胞內鈣失穩態、能量代謝障礙、炎性反應、興奮性氨基酸釋放增加、氧自由基的生成等〔34〕。

長期的研究發現Caspase-3、NF-κB、Bcl-2 /Bax等多種凋亡調控因子均參與了腦缺血再灌注后細胞凋亡的發生，這些因子分別作用于不同的環節,對神經細胞的凋亡起調控作用。此外，在腦缺血再灌注損傷中這些凋亡調控因子并不是單獨表達的，它們之間通過相互作用，共同構成一個復雜的網絡體系調控細胞凋亡的發生。如Caspase-3作為Bcl-2的生理性半胱氨酸蛋白酶，對Bcl-2蛋白具有重要的酶解修飾作用，在細胞發生凋亡時，通過酶切Bcl-2蛋白來抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2作為Caspase-3的上游調控因子，其過度表達可以有效抑制各種因素誘導的Caspase-3激活和由此產生的細胞凋亡〔35〕。Bax可以誘導Cyt-c的釋放，通過細胞凋亡的線粒體通路激活Caspase-3蛋白酶，引起細胞凋亡；同時又可以誘導Bcl-2等抗凋亡相關基因的表達下調〔36〕，加速細胞凋亡。NF-κB激活后可以通過相關途徑上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，阻止Caspase-3等的活化而抑制細胞凋亡。總之，這些凋亡調控因子通過相互作用來共同完成對細胞凋亡的調控，而不僅僅是在各自凋亡通路上單獨發揮作用。因此，對這些細胞凋亡調控因子的深入研究，尤其是將其作為一個整體來綜合研究，將有利于我們進一步探索腦缺血再灌注損傷的機制，為臨床上腦血管病的預防及治療提供新的科學依據。

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