活性肽的生理功能與制備方法研究進展

索江華， 李鳳玲， 郭春燕

（河南牧業經濟學院，河南鄭州450011；2.晉中職業技術學院，山西榆次 030600）

肽是指兩個或兩個以上的氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，生物活性肽簡稱活性肽，是一類分子質量小于6 000 kD，對動物生長和生理機能有重要調控作用的肽。本文就活性肽的吸收機理、生理功能及其制備方法研究進展作一簡述。

1 活性肽的吸收機理

蛋白質是生命的物質基礎，它是由一條或多條具有一定氨基酸序列的多肽鏈構成的大分子。傳統觀點認為，動物日糧中蛋白質的吸收即蛋白質經過胃腸道消化后變成游離的氨基酸吸收入血，再在各組織合成蛋白質，所以將動物蛋白質的營養看成是氨基酸的營養。因此，一些飼料廠家通過添加合成單一的氨基酸來降低飼料中蛋白質的添加量，以節省成本。后來發現通過添加氨基酸，以理想蛋白質模式配制的低蛋白質日糧給動物飼喂，不能取得最佳生產性能。隨著蛋白質技術和理論的發展，其吸收機制也有新的觀點。Smyth和Newey（1962）認為二肽可以被完整吸收。Gardner（1982）研究證實，二肽甚至更長肽鏈可以被完整吸收。二肽與三肽已經被證明吸收的效率比氨基酸高（Nakata等，1995）。目前認為活性肽的吸收需要載體，分別為肽轉運載體Ⅰ和肽轉運載體Ⅱ，這兩種載體都能轉運二肽和三肽（Matthews，2000）。轉運體系有三類：一是依賴pH的Na+/H+交換轉運體系，不消耗ATP（張翠玲，2014）。Takuwa等（1985）發現肽在刷狀緣膜處轉運時出現了H+濃度梯度。 Garapathy 等（1985）、Matthews（1987）提出肽轉運的驅動力是細胞膜兩側的H+梯度。二是依賴H+或Ca2+的主動轉運系統，需要消耗ATP。三是谷胱甘肽（GSH）的跨膜轉運系統。由于谷胱甘肽在生物膜內具有抗氧化的作用，其轉運系統具有特殊的生理意義。肽的吸收與其構型有密切關系，與氨基酸的吸收互不影響，其轉運具有耗能低、轉運速度快、載體不容易飽和等優點。

2 活性肽的功能

2.1 抵抗外源性微生物入侵的作用 生物體為了抵御體外微生物入侵而產生的一類活性多肽被稱作抗菌肽。抗菌肽是一類小分子陽離子短肽的總稱。Boman等（1993）通過注射陰溝桿菌及大腸桿菌誘導蠶蛹產生了具有抗菌活性的多肽。到目前為止科學家們已經發現在植物、昆蟲、微生物、被囊動物、兩棲動物、鳥類、魚類、哺乳動物，乃至人類等多種生物體中發現并分離獲得了多種抗菌肽（滕勇和滕尚輝，2003）。

2.1.1 抗菌作用 天然生物抗菌肽抗菌譜廣，既抑制革蘭氏陽性菌，又對革蘭氏陰性菌起到很好的 抑 制 作 用 （Brofdenk，2005；Vizioli 和 Salzet，2002），特別是對多重耐藥菌具有殺傷作用（劉倚帆等，2010）。目前已經發現的抗真菌肽有cecropins、果蠅抗菌肽、線肽素、貽貝素、蝎血素以及人工改造的各種抗菌肽等（楊陽等，2010）。天蠶素在25～100 mg/L時對鐮刀菌屬和曲霉菌屬的病原菌有殺滅作用（Delucca等，1997）。

抗菌肽抑菌的作用機制主要有：一是破壞細胞膜結構完整性，使其通透性增強，造成胞內物質外溢導致細菌死亡。二是抗菌肽引起細菌形態的改變（Pandey等，2011）。 Lee等（1998）用天蠶素 A和蜂毒素分子的片段合成雜合肽分子，處理真菌孢子原生質體，發現真菌細胞正常形態被破壞。三是作用于胞內靶點的殺菌機制。抗菌肽抑菌作用在胞內主要表現為：（1）干擾細胞壁的合成。人源抗菌肽LL-37攻擊單個大腸桿菌的過程中，發現其干擾分裂隔膜處細胞壁的合成來發揮殺菌作用（PNAS，2011）。 （2）影響蛋白質的合成。Yenugu 等（2004）發現抗菌肽處理的大腸桿菌也能抑制其蛋白質的合成。 （3）抑制酶的活性（Brogdenk，2005）。（4）改變細胞質膜。 （5）與 DNA 結合，抑制 DNA、RNA和蛋白質的合成。Nan等（2009）通過對indolicidin的修飾，發現其類似物能透過大腸桿菌質膜，并在胞內積累與DNA分子結合。螺旋抗菌肽和一些富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽進入到大腸桿菌細胞內后，與胸腺嘧啶、尿嘧啶等結合，抑制 DNA、RNA 合成（Boman，1993）。

2.1.2 抗病毒作用 抗菌肽抗病毒機制主要表現在以下幾方面：（1）病毒有膜結構與病毒外膜結合抑制病毒的作用。如α-防御素對皰疹病毒的作用；美洲鱟素對HIV病毒的作用（Andreu，1999）。（2）抑制病毒的繁殖。如天蠶素A在亞毒性濃度下通過抑制基因表達來阻遏HIV-1病毒的增殖（趙潔等，2008；Wachinger等，1998）。

2.2 對免疫活性的影響

2.2.1 增強免疫活性 能夠增強免疫活性作用的肽被稱作免疫活性肽，其主要是起到免疫調節作用，不僅影響機體的免疫系統，也影響免疫反應和免疫細胞之間相互作用，維持機體免疫功能的穩定，提高機體免疫力。免疫活性肽的作用機制有以下幾個方面：（1）刺激機體淋巴細胞的增殖。Risso等 （1998）報道，Nisin可誘導CD4和CD8細胞的產生，增強細胞免疫功能和T細胞的輔助功能。（2）調節免疫因子的活性。當受到外源菌入侵時，活性肽可促使肥大細胞脫粒化，釋放組胺，使血管舒張，促使釋放入血的有關免疫細胞增多，具有潛在的消滅感染細胞的能力。研究發現α-防御素可促使大鼠腹腔肥大細胞脫粒，作為單核細胞的趨化因子，抑制糖皮質激素合成以及促進上皮細胞的有絲分裂 （Oppenheim等，2003）。另外，傷口感染病菌后，可以通過激活纖維蛋白酶原來抑制纖維蛋白凝塊溶解 （李波，2014）。對NK細胞具有激活作用，梁再賦（2013）報道地龍肽在體外和體內試驗中都有增加巨噬細胞的細胞毒性和NK細胞的殺傷活性，提高巨噬細胞、NK細胞分泌NO、TNF-α的水平，增加巨噬細胞的吞噬功能。

2.2.2 抑制免疫活性 有些肽對免疫具有明顯的抑制作用。這一類肽主要應用于治療自身免疫性疾病和預防抑制排斥反應。如環孢菌素A是十一環肽，已經在器官移植和自身免疫疾病中用作抗炎癥和殺真菌的免疫抑制劑（宋長征，1992）。

2.3 抗氧化作用 抗氧化作用主要通過清除重金屬離子以及與自由基或者可能成為自由基的過氧化物發生氧化還原反應實現的。天然的抗氧化活性肽有肌肽、谷胱甘肽，另外還有大豆蛋白酶解物等，可以抑制體內血紅蛋白、脂氧合酶和體外單線態氧催化的脂肪酸敗的作用。如谷胱甘肽，其作用主要有清除自由基，因在其結構中含有-SH，容易被體內代謝的自由基氧化失去氫而轉變為其氧化型谷胱甘肽，還原的自由基不再損傷生物膜或者侵害生命大分子物質，從而起到保護生命體的作用。肌肽是主要存在于動物肌肉中的天然二肽，具有抗氧化、增強免疫、調節酶活力的作用，主要是通過直接捕獲活性氧成分和自由基、螯合金屬離子等實現抗氧化作用（韓立強，2004）。抗氧化肽有抑制食物在冷藏時的氧化酸敗，在肉制品加工中具有極好的應用前景，且具有高效、低毒等特點，能作為天然抗氧化劑使用。

2.4 促進營養物質吸收

2.4.1 提高日糧蛋白質在體內的沉積量 氨基酸和小肽的吸收機制不同，Hefarty等（1982）研究了蛋白水解物和氨基酸的吸收差異，研究結果表明相同條件下氨基酸和多肽吸收機制不同，肽的氨基酸殘基吸收優于氨基酸。氨基酸以主動轉運方式吸收，是逆梯度進行，必須依靠鈉離子泵轉運系統吸收，需要消耗大量的ATP；而小肽吸收是被動吸收，二者互不干擾，有助于蛋白質在體內的沉積。Pharagyn和 Barley（1987）報道，當精氨酸和賴氨酸以游離形式存在時，兩者相互競爭吸收位點，游離的精氨酸有降低肝門靜脈對賴氨酸吸收的傾向；而精氨酸以肽形式存在時，賴氨酸對其吸收則無影響。

2.4.2 促進礦物質元素吸收 施用暉等 （1996）研究發現，在蛋雞日糧中添加小肽類物質，血液中的Fe2+、Zn2+含量顯著高于對照組，同時也提高蛋殼強度。目前已經證明酪蛋白磷酸肽，是以磷酸絲氨酸為活性中心的肽。通過磷酸絲氨酸與鈣、鋅、鐵等二價金屬離子形成可溶性的螯合物，促進金屬離子由小腸腸壁細胞被動擴散，吸收后再釋放出來，從而有效地避免了鈣在小腸中性和偏堿性環境中被沉淀，促進了鈣的吸收（Reeves等，1958），此外，酪蛋白磷酸肽還可作為錳、銅及硒等礦物質元素的載體，是一種良好的金屬結合肽。

2.5 抗高血壓作用 血管緊張素轉換酶（ACE）在血壓調節過程起到了重要的作用，抑制ACE活性對降低血壓有很好的效果，部分活性肽能起到降低血壓的作用，稱為血管緊張素轉化酶抑制肽（ACEI）（辛志宏和馬海樂，2003）。 Yasun （1996）用Calpis發酵劑發酵的酸奶飼喂自發性高血壓大鼠（SHR），在4～8 h后，SHR的收縮壓降低2.36 MPa以上。隨后又對組織中的ACE酶的活性進行了檢測，結果主動脈中ACE酶的活性降低最多，并發現SHR的主動脈中有兩條三肽（IPP和VPP）起到了降低血壓的作用，推測其抗高血壓作用可能與主動脈中的ACE降低有關。Ferreira和Rocha（1965）從天然蛇毒中發現抑制ACE肽類。Oshima等（1979）選擇了細菌膠原酶降解膠原蛋白獲得了有較強抑制血管素轉化酶的肽，并測出其分子量（在1 000 D以下）和氨基酸組成。 Maruyama（1987、1982）從牛酪蛋白中也成功地獲得了ACEI肽，隨著研究的深入，又從玉米蛋白、沙丁魚、磷蝦、大豆蛋白等中發現新的ACEI活性肽（吳建平，1998）。目前降血壓肽多數來源于乳制品（吳建平，2012）。

3 生物活性肽的制備方法

3.1 生物提取法 因為生物體內富含一些激素類或酶抑制劑等各種天然活性肽，通過一定的工藝對其進行分離提取，如：從酵母中和小麥胚芽中提取谷胱甘肽。因為天然活性肽的含量低，此法較適合用于初步的探索性研究。

3.2 酶水解法 酶水解法是利用酶在最適pH值、最適溫度下進行酶催化的水解反應，根據酶的特異性，使蛋白質水解為不同的肽段，從而得到目標肽。大多數活性肽的生產流程為：原料蛋白→預處理→酶解→分離→精制→成品（杜林和李亞娜，2005）。原料的選擇是基礎，根據目標肽的氨基酸組成或結構來選擇廉價農副產品或者廢水廢物作為原料，如油廠的餅粕類、酒廠的酒糟等。蛋白酶的選擇是關鍵，要求酶既要切出需要的肽段，又要符合食品安全。酶主要有微生物來源、動物來源及植物來源。微生物來源的酶包括酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶及復合酶；動物性蛋白酶包括胃蛋白酶和胰酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶、彈性蛋白酶）；植物蛋白酶有菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶。隨著酶工程的發展，根據需要的活性肽的結構特點，可用酶工程生產特定的酶類 （Gauthier和 Poulit，2003）。此法因為生產條件溫和，易于控制，且氨基酸的營養價值沒有被破壞，隨著發酵工業的發展，蛋白酶的生產量加大，成本降低。

3.3 微生物發酵法 微生物法是利用有益的菌株，接種在蛋白質中，進行發酵，菌株分泌的蛋白酶可以將蛋白切成需要的活性肽，再進行分離提取得到目標肽。根據酶學特性和對底物蛋白分子的利用不同，把菌株進行不同組合，生產合適的肽段。這種方法的關鍵是菌株的篩選。

3.4 人工合成活性肽

3.4.1 化學合成法 依據目標肽的氨基酸排列順序，通過化學方法來合成。根據合成的介質分為液相合成和固相合成。液相合成法是合成小分子肽濃縮多肽片段較好的方法。固相合成法優點是固相載體有利于合成中肽鏈的固定、環化、去保護和純化，但成本較高，副反應及殘留化合物多，限制了規模化生產。

3.4.2 重組DNA技術 通過重組DNA，合成需要的肽段，一旦建立起重組DNA體系，就能生產大量的活性肽。但研發階段要求很高，成本昂貴（吳建平，1998）。

4 前景及展望

有關活性肽生理功能的研究越來越廣泛，對活性肽的吸收、代謝研究越來越深入，其應用范圍也更加廣闊。目前我國原料利用率不高，許多產品的下腳料或者廢棄物中都有豐富的蛋白質資源，通過其制備活性肽，不但成本低廉，而且大大減少了廢棄物排放對環境造成的污染。活性肽易吸收、生物學功能廣、抗菌效果好，無殘留等特性，加上生產低廉，將會產生深遠的社會效益和經濟效益。

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