趨化因子CXCL5在胃癌組織中的表達

姜大力 賈秀月 王偉群

(佳木斯大學附屬第二醫院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154002)

趨化因子生長調節基因(CXCL5)5是促血管生成性趨化因子家族中的一員，可由多種細胞產生，具有很強的粒細胞趨化作用。CXCL5與受體CXCR2結合行使生物學效應。CXCL5可促進非小細胞肺癌、胃癌及子宮內膜癌等腫瘤的發生、發展和轉移。本研究擬探討CXCL5在胃癌中的表達及意義，有望為胃癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1對象 收集佳木斯市各醫院2012年1～5月經臨床確診的胃癌標本36例，切取胃標本中新鮮癌組織(去除壞死組織)和正常黏膜組織(距癌組織10 cm以外，病理學證實無癌浸潤)各兩份，一份標本切下后立刻投入液氮罐中，然后轉入-80℃冰箱內保存，用于提取RNA，行實時熒光定量PCR技術檢測。另一份標本4%甲醛固定，石蠟包埋，進行常規病理檢查和免疫組織化學檢測。男23例，女13例，平均年齡59歲。高中分化18例，低分化18例。TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期13例，Ⅲ/Ⅳ期23例。有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移8例。所有患者術前均未接受化療和放療，經術后病理學證實診斷。

1.2主要試劑 RNA提取試劑Trizol、RNA酶抑制劑、dNTPs等熒光定量PCR試劑、兔抗人趨化因子配體5抗體購自TaKaRa公司，SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒購自武漢博士德公司。操作步驟按試劑盒說明進行。

1.3免疫組化方法 采用SP法。2 μm厚石蠟切片脫蠟水化。經高壓抗原修復，依次加入一抗及二抗后，DAB底物顯色。蘇木素染核，中性樹膠封固。每張切片隨機觀察5個200倍視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞數平均百分比進行計分，再根據染色的強弱進行計分。二者的計分相加。

1.4實時熒光定量PCR方法 引物利用Primer Premier 5.0設計，根據GenBank查找mRNA序列，由TaKaRa公司合成。跨內含子序列，以保證擴增的特異性。CXCL5引物為：正義5′-GACGGTGGAAACAAGGAAAA-3′；反義5′-GCTTAAGCGGCAAA-CATAGG-3′。GAPDH引物為：正義5′-CGACCACTTTGTCAAG-CTCA-3′；反義5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。

按試劑盒說明Trizol提取總RNA。取總RNA1 μg在PCR儀中進行逆轉錄反應合成cDNA：oligo(dt)primer 1 μl，DEPC H2O補齊至12 μl，70℃孵育5 min，置冰上，加入逆轉錄緩沖液1 μl，10 mmol/L dNTP mix 2 μl，37℃孵育5 min，置冰上，逆轉錄酶1 μl，42℃60 min，70℃熱滅活10 min，分裝置-20℃冰箱內保存。25 μl PCR反應體系：模板2 μl，10×PCR 緩沖液2.5 μl，2 mmol/L dNTP mix 1 μl，上下游引物各1 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，Takara Taq DNA聚合酶0.25 μl，ddH2O 15.75 μl。94℃預變性3 min，然后94℃45 s，58℃45 s，72℃45 s，30次循環，然后72℃7 min，最后至4℃終止。制備1.5%及2%瓊脂糖凝膠電泳，取PCR產物18 μl加入6×上樣緩沖液3 μl上樣，另取DNA marker 5 μl，在0.5×TBE電泳緩沖液中以120 V電壓電泳30 min后，紫外燈光下觀察結果。攝像儀將含有產物條帶的電泳圖像掃入電腦，通過凝膠圖像處理系統分析目的基因條帶。進行PCR產物的檢測和分析。

1.5統計學分析 應用SPSS13.0 軟件行χ2檢驗。

2 結 果

2.1實時熒光定量PCR結果 CXCL5在胃癌組織中的表達量為10.02±3.91，明顯高于在胃正常上皮組織的表達量(1.76±0.48)(P<0.000 1)。

2.2免疫組化分析結果 CXCL5蛋白陽性表達主要位于細胞質，呈黃色或棕色顆粒；胃正常組織中大部分細胞呈陰性表達。36例癌旁胃正常組織中，CXCL5蛋白陽性表達12例(33.33%)；36例胃癌組織中CXCL5蛋白陽性表達26例(72.22%)。兩組間CXCL5蛋白表達率比較差異顯著(χ2=10.92，P=0.000 9)。

3 討 論

CXC趨化因子是一組和腫瘤血管生成關系密切的因子，也是腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移的重要調節因子之一。CXCL5與其受體CXCR2結合并介導其趨化作用及血管新生的促進作用。在腫瘤發生發展的過程中，微環境中的血管扮演著重要的角色，其不但促進腫瘤的增殖和侵襲，而且還參與腫瘤的轉移〔1〕。Li等〔2〕研究表明，胰腺癌中 CXCL5 可以激活Akt和STAT 等信號通路最終介導腫瘤組織血管的生成。另外，腫瘤細胞可以自分泌和旁分泌CXCL5 從而促進其自身的存活和增殖。在A549細胞株和鱗狀上皮細胞癌細胞株Calu 1中顯示CXCL5是促血管生長因子〔3〕。Park等〔4〕研究證實，CXCL5的高表達與晚期胃癌及淋巴轉移密切相關。這些表明，CXCL5 參與了腫瘤的侵襲及轉移過程。

本實驗結果充分說明CXCL5在胃癌發生、發展中的重要作用。這可能由于 CXCL5與受體CXCR2結合后作用于酪氨酸激酶受體，從而引起血管內皮細胞增殖、趨化運動及抑制內皮細胞凋亡等一系列促進腫瘤血管新生的生物學效應〔5〕。 此外，CXCL5與特異性受體CXCR2結合后還可通過MAPK和PI3K信號通路，活化轉錄因子ELK1，從而激活一系列與腫瘤形成相關的基因表達〔6〕。CXCL5的過表達能提高胃癌細胞侵襲和轉移能力，并可誘導內皮細胞產生與腫瘤轉移密切相關的基質金屬蛋白酶9(MMP-9)，促進腫瘤的轉移〔7〕。

4 參考文獻

1王偉群，李 揚，李潤生.前列腺癌的間質微環境變化〔J〕.生殖與避孕，2008；28(6):367-70.

2Li A，King J，Moro A，etal.Over expression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol，2011；178(3):1340-9.

3Arenberg D，Keane M，DiGiovine B，etal.Epithelial-neutrophil activating peptide (ENA-78) is an important angiogenic factor in non-small cell lung cancer〔J〕.J Clin Invest，1998；102(3):465-72.

4Park JY，Park KH，Bang S，etal.CXCL5 overexpression is associated with late stage gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2007；133(11):835-40.

5Manna SK，Ramesh GT.Interleukin-8 induces nuclear transcription factor-kappaB through a TRAF6-dependent pathway〔J〕.Biol Chem，2005;280(8):7010-21.

6Maxwell PJ，Gallagher R，Seaton A，etal.HIF-1 and NF-kB-mediated upregulation of CXCR1 and CXCR2 expression promotes cell survival in hypoxic prostate cancer cells〔J〕.Oncogene，2007;26:7333-45.

7Jin Kim Sun，Hisanori Uehara.Expression of interleukin-8 correlates with angiogenesis，tumorigenicity，and metastasis of human prostate cancer cells implanted orthotopically in nude mice〔J〕.Neoplasia,2001;3(1):33-42.