白毛黑眼兔等四種實驗兔黑色素分布的組織學觀察與比較

朱 亮，屠 玨，黃 宇，陳 誠

(浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究中心，杭州 310053)

哺乳動物的虹膜和毛色作為其最醒目的可見性狀，與相應組織中的黑色素分布有密切的關系。哺乳動物體內的黑色素根據胚胎起源的不同可分為多個類型，且調節各個類型黑色素的機制互有差異。當動物的顏色性狀發生突變時，有必要通過組織學的方法弄清突變個體相應組織中的色素細胞類型和數量構成上的變化，從而為后續研究提供線索。我中心從日本大耳白兔種群中發現黑眼突變個體并保種建立封閉群，經鑒定命名為日本大耳兔黑眼系，簡稱白毛黑眼兔(white hair black eyes rabbit，WHBE兔)。現對該封閉群個體的虹膜和皮膚組織進行組織學觀察，并與其他品種實驗兔進行對比。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究選取四個不同品種的實驗兔作為實驗材料：日本大耳白兔、白毛黑眼兔、獺兔和青紫蘭兔。其中，白毛黑眼兔和日本大耳白兔來自于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心實驗兔繁育中心【SCXK(浙)2009-0042】。獺兔購于新昌縣大市聚鎮欣健兔場【SCXK(浙)2009-0042】。青紫蘭兔購于南京安立默科技有限公司【SCXK(蘇)2010-0002】。每個實驗兔品種分別選取2只，雌雄各半。實驗在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心的實驗設施進行【SYXK(浙)2013-0184】。

日本大耳白兔是我國常見的實驗用兔，表型呈現出完全白化，皮膚和被毛雪白(圖1A)，虹膜無色素沉積，呈現紅色(圖1E)。白毛黑眼兔是來自日本大耳白兔種群的突變個體經十四年保種培育而建立的一個新實驗兔封閉群。該品種家兔皮膚和被毛呈現與突變背景品系日本大耳白兔一樣的完全雪白，無任何有色花紋或斑點(圖1B)，而其虹膜則出現色素沉積，呈現深灰色(圖1F)。獺兔和青紫蘭兔是20世紀早期培育于法國，20世紀50年代引入我國的品種。由于長期本地飼養，國內現有獺兔和青紫蘭兔種群與原有品種發生了遺傳分化，并成為我國目前主要的實驗和經濟動物品種。白化獺兔，全身皮膚和被毛雪白，沒有任何斑點或雜色毛(圖1C)，虹膜無色素沉積，呈現紅色(圖1G)。青紫藍兔大部分被毛呈藍灰色，耳尖及尾背面黑色，眼圈、尾底及腹部白色，腹毛基部淡灰色(圖1D)，虹膜呈現深褐色(圖1H)。

1.2 方法

取四個品種的實驗兔實施安樂死后，分別取虹膜組織和背部皮膚組織(2 cm×2 cm)，固定于10%緩沖中性甲醛。組織按常規脫水包埋，切片脫蠟至水，放入硫酸亞鐵液中處理30min。隨后用蒸餾水洗3次，每次5 min。接著用鐵氰化鉀醋酸液處理30 min，隨即用1%醋酸水溶液稍加清洗。作為對比染色，用Van Gieson染液復染約1 min，蒸餾水速洗。最后經95%乙醇脫水、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固等步驟完成制片。光學顯微鏡觀察并拍照。

2 結果

經HE硫酸亞鐵法染色后，黑色素呈現綠色，含量越高則綠色越深，用Van Gieson染液復染的膠原纖維呈紅色，肌纖維呈黃色，染色均勻清晰。圖2顯示組織中黑色素染色效果清晰，黑色素染色與間質組織的背景對比鮮明。

從染色結果可見，虹膜的前表面無上皮，由成纖維細胞和色素細胞組成不連續的前緣層(↑)。虹膜基質為疏松結締組織(*)。白毛黑眼兔和青紫蘭兔的虹膜基質中，靠近虹膜前表面的區域分布著許多被染成墨綠色的黑色素(圖2A、圖2D)。虹膜后表面的虹膜上皮由兩層細胞組成(↑↑)，前層特化為肌上皮細胞，后層由體積較大的色素細胞組成。白毛黑眼兔和青紫蘭兔的虹膜上皮緊密排列著黑色素，形成黑色素層(圖2A、圖2D)。與之相反，日本大耳白兔和白化獺兔的虹膜基質(圖2B、圖2C)和虹膜上皮(圖2B、圖2C)相應部位觀察不到黑色素分布。

家兔身體表皮的角質層很薄。真皮內可見較多毛囊。青紫蘭兔的毛囊內可見被染成墨綠色的黑色素分布(圖2H)。在白毛黑眼兔的真皮層的毛囊中也有黑色素分布，但染色較淺，呈淺綠色(圖2E)。而日本大耳白兔和白化獺兔的表皮真皮層中未觀察到黑色素分布(圖2F、圖2G)。

3 討論

黑色素是產生于特定種類細胞中的一種生物色素，是由酪氨酸經過一系列化學反應所形成的。黑色素生成、轉移和附著的過程稱為色素沉積。不同個體間色素沉積的差異使哺乳動物的體表顏色深淺不一、多種多樣。

哺乳動物的虹膜顏色和皮毛顏色傾向于趨于一致，皮毛顏色深則虹膜顏色也深，反之亦然。但有皮毛和虹膜顏色深淺差異較大的動物品系存在[1]。比如beige小鼠的皮毛呈現較淺的米黃色而虹膜顏色很深。與之類似的是本研究使用的白毛黑眼兔，其虹膜顏色黑而皮毛白，色差極大。

造成這一現象的黑色素體內分布，可以追溯到胚胎發生階段。胚胎學研究的結果顯示，影響皮毛顏色的黑素細胞全部起源于胚胎神經嵴，且僅有這一個來源。而對虹膜來說，其色素細胞有三種不同類型的來源：1)來自于胚胎神經嵴的細胞最終構成了虹膜基質色素細胞；2)位于虹膜色素上皮中的色素細胞則來自于胚胎神經上皮；3)另外，位于虹膜基質中的、來自于骨髓的抗原遞呈細胞也會在吞噬作用的次級影響下成為色素細胞[2]。也就是說與胚胎神經嵴源黑素細胞相關的基因可以同時影響虹膜和皮毛的顏色，而與另兩個黑素細胞胚胎起源相關的基因則只影響虹膜顏色。假設由于基因突變等原因導致胚胎神經嵴起源的黑素細胞缺失，而其他來源黑素細胞正常，可能出現虹膜有色而皮毛無色的情況。本研究通過對不同品種實驗兔組織切片染色結果的觀察，發現白毛黑眼兔的虹膜色素上皮和虹膜基質中都有黑色素分布，跟青紫蘭兔的分布一致。也就是說，白毛黑眼兔表現出的虹膜與皮毛顏色表型的明顯反差并非是由胚胎神經嵴起源的色素細胞缺失造成的。

除此之外，皮毛和虹膜這兩種組織中黑色素補償機制的差異提示我們，參與黑素體轉運的某些蛋白也可以單獨影響皮毛顏色從而出現虹膜有色皮毛無色的表型。哺乳動物皮毛顏色的維持需要黑色素持續地生成并被不斷轉運到生長狀態的毛干里，而虹膜內的黑色素只需生成不需要轉運[3]。對四種實驗兔皮膚組織的鏡檢發現，在白毛黑眼兔的真皮層毛囊中確有黑色素分布，但呈現的染色結果較青紫蘭兔淺得多，顯示黑色素含量較低。而且白毛黑眼兔終生被毛雪白，說明其毛干中不含有黑色素。一般認為，黑色素的轉運機制可以用細胞吞噬理論、釋放理論和融合理論來解釋[4]。目前已有的研究表明，該轉運過程涉及的若干關鍵蛋白與體表色素有直接關系[5-6]。例如，當在黑素顆粒跨膜轉運中起關鍵作用的Rab27蛋白缺乏時，個體會出現以皮膚和毛發色素減退為臨床表現之一的Griscelli綜合征[6]。因此，對黑色素轉運相關蛋白及基因的進一步研究，將對認識白毛黑眼兔突變表型的機制有所幫助。

參考文獻：

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