乳腺癌基因組學研究進展*

張柏林 宋豐舉

乳腺癌是全球女性發病和死亡占第1位的惡性腫瘤［1］。一般認為，乳腺癌的發病是基因與環境共同作用的結果。體細胞突變是乳腺癌發生的必然途徑。體細胞突變分為遺傳性突變和獲得性突變。前者不是癌癥發生所必需的，而后者則由環境暴露刺激形成，在體內逐漸累積，最終引發癌癥［2］。因此，研究腫瘤體細胞突變譜對于明確癌癥的成因和進展過程有重要意義。二代測序技術的出現加速了癌癥基因組學研究的進程，乳腺癌的基因組學研究也隨之取得了突破性進展［3］。二代測序技術在腫瘤基因組學研究中的應用可以歸納為4個方面：1）發現新的突變基因和通路；2）識別特異性突變簽名；3）探索腫瘤的克隆進化；4）促進個體化醫學發展［4］。本文就二代測序技術在乳腺癌基因組學中的研究成果進行綜述。

1 突變基因與通路

在基因組變異與乳腺癌風險的關聯程度中，乳腺癌相關變異可分為常見低風險變異（5%～20%風險）、低頻中等風險變異（2～3倍風險）和罕見高風險變異（可達10倍風險）［5］。以往的關聯研究多集中在高頻率（＞5%）的SNP位點，在大量開展全基因組關聯研究（GWAS）之后，“常見疾病-常見變異”的理論受到了極大的挑戰。因GWAS發現的癌癥相關SNP位點只能解釋5%～10%的癌癥病因，而大部分病因很可能歸于大量的罕見變異的作用［5-6］。因此，“常見疾病-罕見變異”的假說產生。在罕見變異中尋找病因是更大的挑戰，檢測低頻變異需要更大的樣本量，更專業的技術平臺和更龐大的數據分析工作。在大量的低頻體細胞突變中，只有小部分是對癌癥發生有直接作用的“駕駛員”突變，而大部分只是“乘客”突變［7］。只有在大量突變中去偽存真，找到真正的駕駛員突變才能確定病因，以這些可操作突變為依據指導臨床開發出有效的個體化治療手段。

近期開展的乳腺癌二代測序技術報道了乳腺癌相關體細胞突變譜。Shah等［8］分別在80和65例三陰乳腺癌（雌激素受體、孕激素受體和Her-2受體均不表達）患者中進行RNA和DNA測序。Ellis等［9］對77例雌激素受體陽性乳腺癌患者進行DNA測序（46例全基因組測序和31例外顯子組測序）。另有研究分別對100和108例各種類型乳腺癌進行DNA測序，前者全部是全基因組測序，后者包括17例全基因組與外顯子組測序、5例全基因組測序以及86例外顯子組測序［10-11］。該研究常見的體細胞突變基因（＞10%）較少，只有TP53、PTEN和PIK3CA等，而大量存在的是低頻散發突變，包括TBX3、RUNX1、CBFB、AFF2、PIK3R1、PTPN22、PTPRD、NF1、SF3B1和CCND3等。這些突變單個作用有限，一般可歸納為特定的通路。某些突變具有互斥性特點，即兩種突變一般不會同時發生，如TP53和PIK3CA，前者傾向于發生在ER陰性患者，而后者多發生在ER陽性患者。一些突變可能與抗癌治療的反應和耐藥有關，Ellis等［9］認為GATA3突變可能與芳香酶抑制劑治療抑制增殖作用有關。但在一些類型的乳腺癌中無明顯的駕駛員突變，說明可能有不同的機制驅動這些腫瘤的發生，如DNA甲基化等。

通路反映了體細胞突變的共同作用。在乳腺癌中目前共總結了19個相關通路，主要包括PI3K/AKT信號通路、JUN/MAPK通路、凋亡通路、細胞周期通路、TP53信號通路、Wnt信號通路、黏著斑通路、JAK/STAT信號通路、ERBB信號通路和VEGF信號通路等［12］。其中，PI3K/AKT信號通路和JUN/MAPK通路被認為是最重要的2個通路。突變在某些通路的富集說明盡管腫瘤具有遺傳學差異，但由于共同通路的突變而在表型上具有相似性，對治療非常重要。總之，突變基因和通路的發現增加了對乳腺癌及其驅動事件的認知。此外，應該開展功能分析作為癌癥基因組結構分析的補充，以證實這些發現的生物學意義。

2 突變簽名

乳腺癌的發生和發展是多基因、多階段的過程，也是體細胞突變的積累過程，而不同的突變過程都會在基因組內留下痕跡，即突變簽名（mutational signature）［13］。識別癌癥的體細胞突變簽名有助于加深對癌癥生物學的認識。癌癥基因組中的體細胞突變可能來源于多個方面，如DNA修復機制的輕度失真、內源性或外源性突變原的暴露、酶促DNA修飾或DNA修復缺陷等。不同的腫瘤具有各自特征性的突變簽名，有些突變簽名反映了環境因素的作用，如吸煙或導致皮膚癌的紫外線照射等［14］。有些突變簽名則反映了DNA維護異常，如某些大腸癌中發現的DNA錯配修復異常等［15］。通過二代測序分析可以全面揭示遺傳與環境變化在癌癥基因組內留下的簽名。

乳腺癌基因組的堿基突變率低于其他常見成人惡性腫瘤，每1 000個堿基約有1個突變。黑色素瘤和肺鱗狀細胞癌的突變頻率最高，為乳腺癌的10倍。高頻率的突變可能反映了環境因素，如紫外線照射和吸煙等在這2種癌中的作用。在目前確定的全部21種腫瘤突變簽名中，各種腫瘤基因組攜帶的突變簽名從2種到6種不等，乳腺癌中目前確定的突變簽名主要有5種［13］。這些突變簽名有的與年齡有關，如最常見的簽名1B，發生在60%的腫瘤樣本中；有的簽名（如簽名3）與BRCA1/2突變有關，是典型的乳腺癌特異性簽名，只出現在乳腺癌、卵巢癌等少數幾種腫瘤中；另外有2個簽名（簽名2和簽名13）與APOBEC有關，其中簽名2發生頻率為15%，主要特征是TpCpG三核苷酸序列上的C＞T和C＞G突變，與APOBEC胞苷脫氨酶家族成員的過度活性有關，在堿基切除修復和DNA復制機制的共同作用下，使胞嘧啶轉換成尿嘧啶。乳腺癌相關簽名8僅發生在約2%的腫瘤樣本中，其發生機制尚不清楚［13］。在乳腺癌特征性的突變簽名中，并無與環境暴露明確相關的簽名，這與宏觀流行病學發現基本一致。

此外，二代測序技術還發現了2種新的突變簽名，即雷雨（kataegis）［16］和染色體破碎（chromothripsis）［17］。雷雨是指與結構變異共存的體細胞單核苷酸變異集群。染色體破碎是指由單個的染色體破碎重組事件導致的復雜的體細胞結構變異，特征是拷貝數波動和染色體局部大量重排。研究者在乳腺癌14號染色體區域發現密集（多于50個突變）雷雨簽名［13］，反映了該區域基因組重排的特征。

3 瘤內異質性

乳腺癌二代測序研究中最意外的發現是每個腫瘤樣本的測序結果均不重復，突變譜差異極大，這種個性化的結果被稱為腫瘤的異質性［18］。腫瘤異質性包括瘤間異質性和瘤內異質性。前者反映出每個腫瘤都有一個屬于自己的突變通路；而瘤內異質性反映的是多克隆的存在，并非瘤內所有細胞都發生了相同的突變。異質性的存在反映了腫瘤研究的復雜性及個體化腫瘤治療的必要性。瘤內異質性的形成有幾種假說模型：1）細胞起源模型，即突變起源于不同細胞，因而具有異質性。2）遺傳模型，即同一細胞起源，不同初始事件促成腫瘤發生，因而形成異質性。3）混合模型，即不同細胞起源和不同初始事件引起腫瘤發生［19］。

Nik-Zainal等［16］應用二代測序技術繪制了21例乳腺癌患者的亞克隆結構。這項研究發現了重要的信息。首先，在所有研究病例中，既發現了克隆突變，也發現了亞克隆突變，即突變在全部或一部分腫瘤細胞中出現。有趣的是，克隆突變在癌癥發生的早期出現，包含多種癌癥基因的突變，如PIK3CA、p53、Her-2、MYC及CCDN1擴增以及遺傳性乳腺癌BRCA1和BRCA2野生型等位基因的缺失。奇怪的是，盡管很多癌癥基因的突變都是克隆突變，仍然有大量的亞克隆突變存在。事實上，對于多數病例，觀察到的亞克隆突變數量多于克隆突變數量。其次，在所有腫瘤中均有一個優勢克隆占腫瘤細胞的50%～95%。該作者推測優勢克隆的擴張引發了腫瘤的診斷。最后，該研究發現了區分早發和遲發突變的不同突變簽名。早發突變C＞T比例高。同時發現了一個與遺傳性乳腺癌相關的突變簽名。然而，Shah等［8］檢測了三陰乳腺癌患者的克隆異質性，并證實在克隆頻率方面腫瘤變異存在的差異。一些腫瘤中有較少的亞克隆，而另外其他腫瘤中卻有10個以上的亞克隆，與上述的觀察結果不同。盡管p53，PIK3CA和PTEN等癌癥基因突變在多數樣本中均構成最大克隆，但這些突變均不是發生在所有腫瘤細胞的完全克隆。總之，這些研究顯示了乳腺癌持續的遺傳進化和克隆擴增的動態。瘤內異質性在抗癌治療和耐藥以及轉移進展方面的研究正在進行中，在不遠的將來將會獲得具有生物學和臨床雙重意義的信息。

4 個體化醫學

乳腺癌個體化治療有賴于更科學實用的分型，進而針對分型開展有效的臨床工作。乳腺癌的分型經歷了不同的階段，最初是依據形態學的病理分型，70%為浸潤性導管癌，因同種類型的治療效果和預后差異較大［20］，這種分型對臨床指導意義不大。此后發展為表達分型，即以ER、PR和Her-2受體的表達水平為依據分為管狀A/B型（Luminal A/B）、基底樣癌（basal-like）、正常樣癌（normal-like）和Her-2過表達等類型［21］，這種分型有效地指導了臨床治療實踐。在基因組學時代，技術的發展將會帶來更為精細化的乳腺癌分子分型，即基于基因組學信息的乳腺癌分子分型，這將有力的推動乳腺癌的研究，極大加深對乳腺癌的認識，更有效的指導乳腺癌的臨床實踐。

二代測序技術在乳腺癌個體化醫學中的應用已初現端倪。2011年美國癌癥研究會（AACR）年會首次報道了二代測序技術在乳腺癌臨床試驗中的應用。研究者對來自2項臨床試驗的50例ER陽性乳腺癌患者進行全基因組測序，其中26例患者對芳香酶抑制劑敏感、24例耐藥。并發現芳香酶抑制劑耐藥患者的突變數量顯著高于敏感患者。突變負荷可能是判斷治療效果的重要指標［22］。此外另有研究還發現，對MAK3P1突變的ER陽性乳腺癌患者芳香酶抑制劑可能是一種有效的治療方法，而TP53突變患者則通常對芳香酶抑制劑耐藥，應該選擇其他治療方式［9］。在另外一項研究中，對三陰乳腺癌轉移患者開展二代測序，發現全部14例患者中均存在激活MAPK通路和PI3K/AKT通路的突變。基于這項發現，研究者建立了一項新的Ⅰ期臨床試驗，對患者開展MEK聯合AKT抑制劑治療［23］。盡管這些研究只是二代測序在臨床試驗中應用的開端，但成功的經驗將對后續大規模臨床研究具有指導意義。二代測序臨床應用的真正意義在于能夠通過測序獲得患者基因組和轉錄組信息，選擇適合于患者的治療手段。隨著二代測序速度逐漸加快，成本逐漸降低，大規模臨床應用正在逐漸成為現實［22］。

5 結語

近期開展的二代測序研究較為全面系統地檢測了乳腺癌基因組，推進了對乳腺癌發生發展的認識。研究發現了新的突變基因和通路，總結了突變簽名和克隆進化，并對乳腺癌個體化醫學進行了初步的探索。二代測序開啟了乳腺癌基因組學研究的新篇章，未來的研究可以著力增大研究樣本，開展多中心聯合研究，開展比較基因組學研究，如不同腫瘤類型間的比較，原發癌與轉移癌的比較等。進行組學分析與功能實驗相結合，如在模式生物中研究特定環境暴露引發突變譜等，開發更強有力的數據分析系統，以應對海量測序數據，挖掘更有價值的信息。

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