Array-CGH技術在產前診斷不平衡染色體改變中的應用

宮玉典劉文娟

（1煙臺市心理康復醫院，山東 煙臺265200；2煙臺市萊陽中心醫院，山東 煙臺 265200）

Array-CGH技術在產前診斷不平衡染色體改變中的應用

宮玉典1劉文娟2

（1煙臺市心理康復醫院，山東 煙臺265200；2煙臺市萊陽中心醫院，山東 煙臺 265200）

Array-CGH技術；產前診斷；染色體不平衡；應用

隨著全球污染的逐漸加重，越來越多的新生兒出生時帶有遺 傳基因缺陷。我國存在出生缺陷的新生兒人數占總出生人數的5%左右，近幾年出生缺陷發生率在逐年增加[1]。染色體不平衡畸變，其是導致人類先天性畸變最重要也是最常見的原因，其發病率占先天疾病發病率的20%左右[2]。Array-CGH的主要原理是將待測DNA與對照DNA使用不同熒光的生物素標記，二者等量混合，使用足量的人Cot-1DNA抑制分散重復序列，將混合物雜交于微陣列芯片上，微陣列中包括全基因組DNA，當待測DNA存在片段缺失時，對照DNA先與微陣列上的全基因組DNA結合，當DNA存在片段擴增時，待測DNA先與全基因組DNA結合，當待測片段既不存在缺失也不存在擴增，即DNA片段平衡時，對照DNA與待測DNA與全基因組DNA競爭性結合，收集結合的熒光信號，將熒光信號使用分析軟件處理[3]。對染色體不平衡的產前檢查可以有效降低出生缺陷率，改善妊娠結局，目前不平衡染色體的產前檢查手段主要有G顯帶核型分析，熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，FISH），光譜核型分析技術（spectral karyotyping，SKY）等，但這些技術的檢出率低，漏查率高，本研究使用Array-CGH技術對不平衡染色體進行產前檢查，期望尋找到準確，有效，方便的不平衡染色體產前檢測技術。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年7月至2013年7月在我院行染色體檢查的18例產婦，其中染色體核型正常產婦4例，疑似染色體異常病例14例，其中G顯帶核型分析提示染色體異常但未檢測出染色體大片段不平衡畸變的病例8例，G顯帶核型分析未提示染色體微小片段不平衡畸變的病例6例。

1.2 方法

1.2.1 Array-CGH技術檢測

樣品準備：提取病例外周血及羊水基因組DNA樣品，使用NSPⅠ限制性內切酶消化2 h，使用T4 DNA連接酶連接接頭3 h。底物使用PCR進行擴增，PCR擴增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，60.0 ℃45 ℃，72 ℃ 1 min45s，35循環，72 ℃ 10 min。使用磁珠吸附法純化PCR擴增產物，使用末端轉移酶在提純的DNA產物末端標記生物素，并將DNA變性。探針變性：將標記的樣本加入雜交液混勻，變性10 min制成DNA探針。將探針加入芯片中50 ℃反應24 h。洗滌和染色：將雜交后的芯片使用洗滌液清洗，并使用SAPE染色液進行染色，之后加入生物素標記的羊抗鏈酶親和素抗體與探針結合。結果分析：使用Genotyping Console及GCOS軟件進行信號掃描與信號強度分析。

1.2.2 熒光原位雜交技術檢測驗證

標本制備：使用常規方法制備染色體標本，室溫放置備用。標本變性，將標本放入65 ℃預熱的70%甲酰胺中2 min變性，將變性后的標本放入70%、90%、100%的乙醇中進行梯度脫水各2 min，之后將樣本取出，室溫放置晾干。探針變性：將生物素標記的探針70 ℃水浴變性10 min，再使用水浴退火。雜交：將變性后的探針加于變性后的DNA樣本玻片之上，加蓋玻片進行封片，將樣本置于37 ℃環境中過夜。洗滌：將樣本置于SSC液中5 min中，再使用50%甲酰胺洗滌2次，每次5 min，使用SSC液洗滌2次，每次5 min。將抗體加在樣本玻片上，37 ℃孵育20 min，使用SSC洗滌3次，每次5 min。在樣品玻片上加入DAPI封片液封片。結果檢測：使用熒光顯微鏡觀察樣本。

1.3 數據統計

本研究數據應用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。計量采用均數土標準差（）表示，使用方差分析（One-way ANOVA）分析各組組間差異，計數資料使用卡方檢驗進行比較，均以P＜0.05作為具有顯著性差異。

2 結 果

2.1 Array-CGH檢測結果

對25例患者進行array-CGH分析，確診14例G顯帶核型分析未能明確診斷的染色體不平衡畸變，其中染色體微缺失6例，染色體大片段缺失2例，染色體片段重復3例，片段重復合并缺失的3例。

2.2 Array-CGH檢測結果與G顯帶核型分析檢測結果對比

患者中有4例G顯帶核型分析未能明確診斷的染色體不平衡畸變。病例1：G顯帶核型結果為46，XY，r（11）（q9q34？），array-CGH結果為46，XY del（11）（q33.2-q34）。病例1 G顯帶結果未能明確染色體發生缺失時染色體的斷裂位點與缺失片段長度，array-CGH結果顯示病例11號染色體的長臂發生缺失，其位置為正常片段的105239475-117459863bp。病例2：G顯帶核型結果為46，XY，add（13）（q10？），array-CGH結果為46，XY dup（13q11.3-q21.3）。病例2 G顯帶結果未能明確染色體發生畸變的片段，array-CGH結果顯示病例13號染色體發生片段自身重復，其位置為正常片段的46825793-86359724bp。病例3：G顯帶核型結果為46，XY，add（11）（p11？），array-CGH結果為46，XY，dup（11）（p20.4-p10.4），del（11）（p21.6-p20.6）。病例3 G顯帶結果未能明確染色體發生不平衡畸變的模式，array-CGH結果顯示病例11號染色體發生重復合并缺失的染色體不平衡畸變，其中，重復片段位置為正常片段的21365947-36594219bp，缺失片段位置為正常片段位置69548271bp-78426921bp。病例4：G顯帶核型結果為46，XY，add（8）（q11？），pat，array-CGH結果為46，XY ，dup（8）（8q11-q21）。病例4 G顯帶結果未能明確染色體發生自身重復的位點與缺失片段長度，array-CGH結果顯示病例8號染色體的長臂發生自身重復，其位置為正常片段的26354985bp-59687125bp。

3 討 論

目前不平衡染色體的產前檢查手段主要有G顯帶核型分析，FISH，SKY等，但這些技術存在缺陷，降低了不平衡染色體產前檢查的準確性。如G顯帶核型分析對染色體微小片段結構異常的分辨率差，如對5Mb以下的染色體結構異常的檢出率為30%左右，漏診率可高達70%左右。FISH對染色體數目異常的檢測準確度高，但對染色體結構異常的檢測準確度低。SKY的不足之處是其無法顯示染色體發生結構異常的物理位置。本研究array-CGH結果不僅明確了患者發生染色體畸變的類型，還確定了染色體結構發生異常的具體位置。Array-CGH可對染色體結構的異常做出明確診斷，為臨床預計妊娠結局，并做出相應治療提供依據。

[1] Vialard F,Molina Gomes D,Leroy N,et al.Array comparative genomic hybridization in prenatal diagnosis:another experience[J].Fetal Diagn Ther,2009,25(2):277-284.

[2] Law L W,Lau TK,Fung TY,et al.De nove 16p13.11 microdeletion identified by high-resolution array CGH in a fetus with increased nuchal translucency[J].BJOG,2009,116(2):339-343.

[3] Kashork CD,Theisen A,Shaffer LG.Prenatal diagnosis using array CGH[J].Methods Mol Biol,2008,444(1):59-69.

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：B

：1671-8194（2014）06-0051-02